藥用菊花組織培養(yǎng)技術(shù)研究進展

趙維萍 王艷琪 劉洋

摘? 要：該文分析了藥菊組織培養(yǎng)過程中存在的問題，歸納總結(jié)了藥菊的病毒檢測及脫毒方法、外植體的選擇和處理以及組織培養(yǎng)過程中各個階段的優(yōu)良培養(yǎng)基的選擇和培養(yǎng)的條件。

關鍵詞：藥菊;病毒檢測;脫毒;階段培養(yǎng)

中圖分類號 S682.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0036-4

Abstract：Based on the analysis of the problems in tissue culture in recent years，the methods of virus detection and detoxification，the selection and treatment of explants，and the selection and culture conditions of fine culture medium in each stage of tissue culture were summarized.

Key words：Medicinal Chrysanthemum;Virus detection;virus-free;Stage culture

滁菊、貢菊、杭菊、亳菊共稱為中國4大藥菊[1]，《中藥志》與《中華本草》中稱滁菊和亳菊的品質(zhì)最優(yōu)。藥菊的主要有效成分有黃酮、氨基酸、揮發(fā)油和絹云母、麥飯石等礦物質(zhì)，以及鋅、硒等多種微量元素，具有清熱解毒、護膽明目、舒筋活血、解瘡毒以及增強免疫力的功效。現(xiàn)代藥理學研究認為，藥用菊花具有改善心血管功能、抗癌、抗菌、擴血管、抗氧化等作用，是藥用和飲料兼用的優(yōu)良中藥材[2-7]。

1 藥菊組織培養(yǎng)的意義及存在的問題

藥菊的繁殖方式主要有分株、插條等，這類方法便于推廣、且成本低。但在長期的生產(chǎn)中，由于連作、病害累積及復合侵染等因素，造成菊花花朵偏小、生長勢減弱、抗逆性變差、葉上會出現(xiàn)明顯斑點等問題，使菊花的品質(zhì)和經(jīng)濟價值大大降低，從而影響了藥菊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[8，9]。在自然條件下，病毒一旦侵入到植物體內(nèi)，就很難根除，要想有效地實現(xiàn)藥菊的脫毒和復壯，植物組織培養(yǎng)是一個非常好的手段。

植物組織培養(yǎng)是20世紀發(fā)展起來的一項新技術(shù)，近30年來發(fā)展極為迅速[10]，其技術(shù)的優(yōu)點在于：培養(yǎng)條件可控，在室內(nèi)培養(yǎng)，不受外界多變的環(huán)境影響。選用組培脫毒苗進行栽培，不僅可以增強藥菊的適應能力和抗逆能力，提高品質(zhì)，而且減少了農(nóng)藥在栽培過程中的使用量。藥菊的組織培養(yǎng)，對于生態(tài)環(huán)境的保護和藥菊的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義[11]。

目前，藥菊組織培養(yǎng)技術(shù)雖已經(jīng)已有了很大的提高，但培養(yǎng)過程中仍存在內(nèi)生菌、褐變和試管苗玻璃化等現(xiàn)象，以及優(yōu)良品種生根困難等問題。因此，不同品種的藥菊組織培養(yǎng)仍需進一步探討[12，13]。

2 藥菊的病毒檢測及脫毒方法

病毒檢測是運用一些簡單可靠的技術(shù)方法來判斷植物病害是由哪種病毒引發(fā)的。植物的病毒檢測在傳統(tǒng)檢測方法的基礎上已經(jīng)得到了完善，檢測速度及準確性也大幅提高。目前，菊花病毒的檢測技術(shù)主要有生物學檢測、電子顯微鏡檢測、分子生物學檢測及血清學檢測等[9，14]。藥菊脫毒的方法主要有：莖尖組織培養(yǎng)脫毒法、熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)脫毒法、化學處理脫毒法、超低溫結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)脫毒法[9]。

3 藥菊組織培養(yǎng)的原理

植物組織培養(yǎng)是指在無菌的條件下，將離體的器官、組織（細胞、胚胎、原生質(zhì)體等）接種在人工配置的培養(yǎng)基上，并設定適宜的環(huán)境條件，經(jīng)過脫分化形成愈傷組織、再分化培育成1株完整的植株[10]。進行藥菊的組織培養(yǎng)時，外植體一般都選取生長良好、無病蟲害的植株。根據(jù)組織培養(yǎng)的植物細胞全能性的原理，菊花的任何部位都可以作為植物組織培養(yǎng)的外植體材料，但是菊花的不同部位的分化能力有所不同，所以在組織培養(yǎng)時應該根據(jù)具體情況選擇合適的外植體。周瑞玲等用菊花的莖尖、莖段和側(cè)芽作為外植體進行對比試驗，在后續(xù)研究菊花的組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)以莖尖外植體最好[15]。梁稱福等用菊花的嫩莖段作為材料建立無菌體系，再進行誘導芽分化、生根等試驗，探討了菊花組織培養(yǎng)快繁的技術(shù)[16]。齊向英等以菊花當年生莖段為材料，進行初代培養(yǎng)[17]。劉鵬等以菊花莖尖作為外植體進行脫毒培養(yǎng)[18]。司懷軍等利用‘熬霜幼嫩花瓣為外植體材料[19]。劉興玉等以菊花花瓣為外植體進行組培快繁并取得成功[20]。符運柳等分別以菊花腦的頂芽和腋芽為外植體進行組培研究[21]，經(jīng)多年的研究表明，采用藥菊莖尖分生組織建立無菌體系最好，并且取莖尖分生組織頂端處圓錐區(qū)內(nèi)的長度不超過0.1mm，但實際操作非常困難且不易成活，目前藥菊組織培養(yǎng)所取的莖尖均超過了0.1mm。

4 藥菊組織培養(yǎng)技術(shù)研究進展

4.1 外植體的處理 外植體的處理非常重要，若消毒劑使用不恰當或者處理時間不當，內(nèi)源菌未徹底處理，后期會影響外植體的生長發(fā)育。外植體剛從野外采摘回來時應先用流水清洗干凈，如果表面污垢比較多，可以適當?shù)氖褂孟匆路鄣?。不同的外植體在使用消毒劑時的處理時有一定的差異，顧昌華等對菊花外植體的消毒處理，分別使用了7種不同消毒劑進行處理，研究不同消毒劑的消毒效果，結(jié)果表明，菊花的外植體頂芽用2%次氯酸鈉+0.1%升汞消毒各5min，側(cè)芽以0.1%升汞消毒5min后效果最佳[22]。經(jīng)過消毒劑處理過的外植體，再用無菌水沖洗5～6次即可[23]。

4.2 環(huán)境條件 藥菊在培養(yǎng)基含量為1/4MS～2MS的條件下，其苗高、葉面面積、葉綠素含量、鮮重、干重均呈現(xiàn)出隨著培養(yǎng)基含量的增加而升高的趨勢;不添加蔗糖，藥菊組培苗將停止生長甚至死亡，當蔗糖濃度在1.5%～4.5%時，其苗高、葉面面積、葉綠素含量、鮮重、干重均呈現(xiàn)出隨蔗糖濃度的增加而升高的趨勢，但藥菊的增殖系數(shù)卻表現(xiàn)為先增后降的趨勢。由此認為，培養(yǎng)的最佳條件為MS+蔗糖3%[24]。瓊脂是培養(yǎng)基中的固化劑，適量的瓊脂有利于藥菊植株的生長，隨著瓊脂濃度的增加，其膠凝粘聚性、硬度、彈性也增加，瓊脂含量過高時，培養(yǎng)基的硬度過大，其透氣性降低，從而導致藥菊植株吸收營養(yǎng)物質(zhì)困難，根系形成也將受到影響。因此，適宜的培養(yǎng)基瓊脂含量對藥菊組織培養(yǎng)具有重要的意義。MS培養(yǎng)基中一般添加0.7%～0.8%的瓊脂，再加入不同種類和濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑進行不定芽的誘導、增殖和生根培養(yǎng)。在植物組織培養(yǎng)過程中，不同的植物或品種需要的培養(yǎng)環(huán)境及條件也有很大差異。對于藥菊的組織培養(yǎng)而言，不同的溫度、濕度、光照強度、酸堿度、培養(yǎng)時間等都會影響到外植體的脫分化和再分化，從而影響后期誘導不定芽的數(shù)量、擴繁的速度、植株根的數(shù)量以及葉片中葉綠素含量等。較弱的光照有利于藥菊愈傷組織不定芽的誘導、增殖和植株生長、根數(shù)的增多，較強的光照有利于芽的生長、葉片的發(fā)生和根的伸長，過強的光照會造成芽色變白和苗色變淡。研究表明，藥菊組織培養(yǎng)的光照強度一般為2000～3000lx，光照培養(yǎng)時間為12h/d，黑暗培養(yǎng)時間為12h/d，適宜的溫度為（25±1）℃。相對濕度也是影響組培苗生長發(fā)育的重要因素，相對濕度過高，容易引起培養(yǎng)物的污染和玻璃化等問題，還會改變試管苗的葉片結(jié)構(gòu)，降低蒸騰拉力，嚴重影響其正常生長，一般認為，80%左右的相對濕度較適合組培苗的生長。另外，培養(yǎng)基酸堿度也能影響外植體對培養(yǎng)基中營養(yǎng)的吸收，不適宜的pH可能會導致組培植株的褐變或玻璃化等[23，25]。從藥菊的組織培養(yǎng)研究進展可知，組培苗的適宜培養(yǎng)基的pH在5.8～6.0。

在藥菊植物組織的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加適量的活性炭，可提高培養(yǎng)體內(nèi)可溶性蛋白和總糖的含量，模擬和自然環(huán)境土壤類似的黑暗環(huán)境，并且可以吸附組培植株在生長過程中分泌的物質(zhì)和容器中某些氣體成分來減少不利因素對植株的影響，防止褐化和促進生根的作用[26]。

4.3 階段式培養(yǎng)

4.3.1 初代培養(yǎng) 藥菊以MS作為初代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，外加適量6-BA、NAA、KT或TDZ等生長調(diào)節(jié)劑。在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的細胞分裂素、生長素等有一定比例，一般來說，較高濃度的細胞分裂素有利于形成不定芽，較高濃度的生長素有利于形成根;當細胞分裂素和生長素處于一定平衡的濃度時，有利于形成愈傷組織[27]。鄧衍明等在研究滁菊脫毒苗時，采用改良的熱處理結(jié)合植株莖尖分生組織培養(yǎng)的方法，建立了滁菊組織培養(yǎng)脫毒苗快繁技術(shù)體系，得出滁菊莖段誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA;滁菊的莖尖增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA[14]。王康才等在研究杭菊時，用杭菊露白期的花瓣作外植體進行研究，得到最佳的誘導愈傷組織培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L NAA+2mg/L KT[28]。鄧年芳等以菊花的花瓣作為外植體進行組培快繁技術(shù)的研究，得出誘導菊花愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA[29]。薛建平等以藥菊的葉片作為外植體，用背接的方式接于MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA誘導植株再生效果最好[23]。蔣細旺等以菊花為試材，分別以莖段和葉片作為外植體，研究不同的植物激素對離體培養(yǎng)的植株生長的影響，實驗表明杭白菊最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1～0.2mg/L NAA[30]。候玉杰等以菊花側(cè)芽莖尖作為外植體進行組織培養(yǎng)實驗，得出菊花莖尖離體培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基為MS+5.0mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA[31]。孫景欣用菊花切花“黃秀鳳”的莖尖作為外植體，得到誘導愈傷組織最佳的培養(yǎng)基為MS+0.2～1mg/L NAA，叢生芽長勢強[32]。誘導芽分化并不一定需要加入植物激素，符運柳等分別以菊花腦的頂芽和腋芽為外植體進行組培研究，結(jié)果表明，在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，就能誘導出不定芽[21]。湯雪燕以菊花花托作為外植體，在MS培養(yǎng)基中加入6-BA 0.4mg/L十TDZ 2.0mg/L+ NAA0.3 mg/L時，形成愈傷組織多，愈傷組織結(jié)實，芽誘導效果最好[33]。李卓姣用菱葉菊幼嫩莖尖為材料進行組培繁殖研究，得出菱葉菊最適不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 3mg/L+NAA 1mg/L[34]。從以上研究結(jié)果可以得出：誘導菊花愈傷組織的最適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.4mg/L+TDZ 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L。

4.3.2 繼代培養(yǎng) 藥菊繼代培養(yǎng)是組培擴繁獲得大量無根苗的重要方法。一般有以下2種途徑，一是將愈傷組織上的從芽分離，將分離的藥菊愈傷組織塊接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化成更多的芽;二是將長成的無根試管苗切成帶葉或帶芽的小段，接種于培養(yǎng)基上，然后長成幼苗[35]。候玉杰在MS基礎培養(yǎng)基上附加3.0mg/L 6-BA和0.01mg/LNAA進行菊花繼代培養(yǎng)時，芽苗長勢較旺，適宜作為菊花繼代培養(yǎng)擴大繁殖的培養(yǎng)基[31]。符運柳等分別以菊花腦的頂芽和腋芽作為組織培養(yǎng)的外植體進行研究，認為適宜菊花的增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA[21]。經(jīng)研究者的重復實驗和各個實驗結(jié)果對比可知，藥菊組織培養(yǎng)快速繁殖的最適培養(yǎng)基為MS+3.0mg/L 6-BA+0.01mg/LNAA。

4.3.3 生根培養(yǎng) 鄧衍明等在研究滁菊脫毒苗時，表明滁菊生根培養(yǎng)最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA[14]。黃丹楓等通過實驗得出誘導滁菊組培苗生根的適宜培養(yǎng)基是1/2MS+0.2mg/L IBA[36]。符運柳等認為適合誘導藥菊生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA[21]。袁成志等認為誘導生根的最佳培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.1mg/L[37]。劉金等認為在1/2MS+1mg/LIAA或1/2MS+0.2mg/L NAA培養(yǎng)基最有利于生根[18]。鄧年芳等用1/2MS+0.5mg/L NAA作生根培養(yǎng)基，生根率可達100%[29]，能夠穩(wěn)定地生根是煉苗移栽的必要條件。從以上綜述的各個生根培養(yǎng)的實驗結(jié)果來看，1/2MS+0.5mg/L NAA作為生根培養(yǎng)基的效果最佳。

4.4 煉苗與移栽基質(zhì) 由于藥菊組培苗從接種到長成完整的植株一直是在比較適宜并且可控的室內(nèi)環(huán)境下，當組培苗從組培瓶中移出后，其生長環(huán)境必然發(fā)生很大變化，自然環(huán)境會影響到幼苗的成活率。所以移栽前需要先進行煉苗，煉苗方法如下：生根的組培苗長到苗高約3cm左右，白根露出，有側(cè)根時可以進行煉苗。朱濤等研究表明，3d為煉苗合適的時間，此時幼苗的成活率最高，可達95%以上，少于或多于這一時間，都會引起成活率下降，如果煉苗時間過短，幼苗將不能很好地適應環(huán)境變化;煉苗時間過長，則幼苗榮易感染細菌病毒[30]。經(jīng)過煉苗后，將組培苗取出，用清水小心洗去根部殘留培養(yǎng)基，用多菌靈或百菌清洗液殺菌1～2min，然后移栽到基質(zhì)中。煉苗基質(zhì)一般有2種：一種是泥沙土與腐質(zhì)土，另一種是石+珍珠巖+腐質(zhì)秸稈[1]，也有的移栽基質(zhì)采用泥炭與椰糖各半的混合基質(zhì)[38]?？傊?，煉苗時保證組培苗能夠適應外界環(huán)境是關鍵，移栽時選擇透氣性好，保水性能高的基質(zhì)。

5 結(jié)語

藥菊作為藥用草本植物，其藥用價值不容小覷，醫(yī)藥業(yè)對于藥菊的需求不斷地增多，但是各種藥菊的地域性都很強，對于生長環(huán)境的要求也非常高。就目前而言，藥菊的生產(chǎn)仍屬于小規(guī)模生產(chǎn)，并沒有實現(xiàn)工廠化和自動化生產(chǎn)，如何利用有效的地域來獲得更多品質(zhì)優(yōu)良的菊藥，是人們關注的問題。藥菊在長期的栽培過程中出現(xiàn)了各種問題，導致產(chǎn)量并不理想，因此，研究藥菊的脫毒苗的組織培養(yǎng)技術(shù)十分必要。近年來，藥菊組織培養(yǎng)雖取得了較大的進步，但是藥菊的脫毒手段、病毒檢測以及各個階段的組織培養(yǎng)等都還有很大的空間進步，需要今后不斷地研究探索。

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（責編：張宏民）