入侵植物喜旱蓮子草對銅綠微囊藻的化感作用研究

程萌 李丹 張猛

摘? 要：為了探究控制微囊藻暴發(fā)以及喜旱蓮子草綜合利用的方法，以喜旱蓮子草（Alternanthera philoxeroides）為供體，銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受體，利用喜旱蓮子草不同部位的乙醇浸提液對銅綠微囊藻進行室內(nèi)控制培養(yǎng)，分析其生長狀態(tài)。結(jié)果表明：（1）與對照組相比，喜旱蓮子草乙醇浸提物對銅綠微囊藻的生長具有明的顯抑制作用，藻體數(shù)量降低36.95%～95.14%;微囊藻溶液相對電導(dǎo)率增加0.50%～29.19%;（2）微囊藻溶液葉綠素a含量隨著浸提物濃度增加呈現(xiàn)出不同的效應(yīng)，在低濃度（c≤70g/mL）時表現(xiàn)為促進，葉綠素a含量增加19.41%～762.99%;高濃度（c>70g/mL）時表現(xiàn)為抑制，溶液中葉綠素a降低10.15%～75.94%;（3）除喜旱蓮子草地上部分浸提物在最高濃度（280g/L）影響下，微囊藻溶液COD增加12.43%外，而其他濃度處理（≤140g/L）使微囊藻溶液COD降低13.15%～66.84%;（4）通過比較不同指標(biāo)的化感效應(yīng)指數(shù)表明，喜旱蓮子草不同部位浸提液的化感作用強弱不同，表現(xiàn)為地下部分浸提物化感作用明顯強于地上部分。

關(guān)鍵詞：入侵生物;化感作用;浸提物;喜旱蓮子草;銅綠微囊藻

中圖分類號 Q948.12+2.1文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0032-4

Abstract：In order to explore resource utilization of a invasive plant and biological control of the Microcystis，indoor bioassay was adopted to study the allelopathic effects of a invasive plant，namely Alternanthera philoxeroides，on Microcystis aeruginosa. The results show that：（1）The ethanol extracts of A. philoxeroides significantly inhibited the growth of M. aeruginosa significantly，and the extracts reduced the number of M. aeruginosa by 36.95%-95.14%;the relative electric conductivity of M. aeruginosa increased 0.50%-29.19%;（2） the concentration of the ethanol extraction of A.philoxeroides has significant difference on the chlorophyll of Microcystis solution，the change of chlorophyll under different controls shows a trend of promotion in low concentration （c≤70g/L） and inhibition in high concentration（c>70g/L） content;（3） the effect of 280g/mL extract of aboveground organization of the host plant had more significant difference on COD of Microcystis solution than others，the COD of the solution under 280g/mL increased by 12.43%，while the index under other controls decreased by 13.15% to 66.84% compared with the control;（4） compared with RI of different controls of the extracts of A. philoxeroides，the inhibition of allelopathy from belowground organizations was stronger than of allelopathy from aboveground parts at the same concentration.

Key words：Invasive species;Allelopathic effect;Ethanol extraction;Alternanthera philoxeroid;Microcystis aeruginosa

喜旱蓮子草（Alternanthera philoxeroides），又名空心蓮子草，俗稱“水花生”，為莧科、蓮子草屬多年生宿根性草本植物。該物種原產(chǎn)于巴西，其生命力頑強，適應(yīng)性強，廣泛分布于多個國家和地區(qū)[1]。20世紀(jì)30年代引種至中國，目前已經(jīng)在我國28個省市區(qū)均有分布[2]。由于其自身的生物、生態(tài)學(xué)特性，該植物生長迅速，具有明顯的競爭能力，易于對入侵地的生態(tài)環(huán)境、生產(chǎn)生活等產(chǎn)生負(fù)面影響[3-4]。

近年來，針對該入侵植物的綜合利用與防治的研究，越來越引起人們的關(guān)注[5]。喜旱蓮子草常被用作肥料、動物飼料，食用菌培養(yǎng)基原料也可作為生物質(zhì)能源發(fā)展沼氣，同時可以用于水質(zhì)凈化。研究表明，喜旱蓮子草通過其植株的化感作用[6-8]，影響其他生物的生長。

現(xiàn)階段，隨著我國水體富營養(yǎng)化程度的加劇，在巢湖、滇池等湖泊中“水華”暴發(fā)頻繁，有害藻中以藍(lán)藻和綠藻在數(shù)量和發(fā)生頻率上均占有優(yōu)勢[9]，在藻細(xì)胞死亡或細(xì)胞膜通透性增強時會向水中釋放藻毒素，破壞水質(zhì)，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)失衡，危害人體健康[7]。因此，如何抑制藍(lán)藻的生長、控制水體富營養(yǎng)化已成為水污染治理的研究熱點和亟待解決的問題。為此，國內(nèi)外很多研究者進行了相關(guān)研究，開展了控制水華暴發(fā)不同方法的研究[10]。筆者在野外進行巢湖水體污染水體狀況調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在喜旱蓮子草密集生長水體中藍(lán)藻數(shù)量普遍較少甚至沒有。據(jù)此，筆者假設(shè)喜旱蓮子草的化感物質(zhì)對藍(lán)藻的發(fā)生具有一定的影響，存在一定的抑制作用。

本實驗以入侵植物喜旱蓮子草為供體，以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受體，研究喜旱蓮子草不同器官乙醇浸提物對于其生長的影響，為綜合利用入侵植物喜旱蓮子草以及控制微囊藻引發(fā)的水華現(xiàn)象等方面研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇 2013年8月，在合肥市蜀山區(qū)四里河路至潛山路南淝河段岸邊挖取喜旱蓮子草完整植株，洗凈晾干，分揀地上與地下部分備用。2013年8月，在安徽巢湖第4取水口撈取藍(lán)藻，稀釋20倍后在顯微操作臺上分離出銅綠微囊藻備用。

1.2 研究方法

1.2.1 微囊藻培養(yǎng) 選擇培養(yǎng)藻類常用BG-11培養(yǎng)基[7]。將100mL培養(yǎng)基置于250mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌處理15～20min，向培養(yǎng)基內(nèi)加入已分離出的銅綠微囊藻，然后放入人工氣候箱，溫度（25±1）℃、光照2000lx、光周期16L∶8D，對微囊藻進行擴大培養(yǎng)，每天晃動2次。

1.2.2 制備喜旱蓮子草浸提物 將分離完成的喜旱蓮子草地上部分和地下部分分別置于烘箱內(nèi)105℃烘干，粉碎。參考文獻提取方式，取70g干物質(zhì)通過100mL 95%乙醇利用索式提取器進行提取，將提取液過3層紗布過濾處理放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至膏狀，密封，置于4℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2.3 材料處理及培養(yǎng) 將BG-11培養(yǎng)基100mL放置于250mL滅菌過的錐形瓶，加入擴大培養(yǎng)的銅綠微囊藻溶液3mL，再次擴大培養(yǎng)14d。將喜旱蓮子草的地上、地下部分浸提物物用75mL蒸餾水配置成母液（280g/L），然后稀釋成140g/L、70g/L、35g/L、17.5g/L等不同濃度溶液，實驗中設(shè)置蒸餾水做空白對照組（0g/L）。實驗共設(shè)置11組處理，每組5個重復(fù)。分別取以上11組溶液3mL加入到微囊藻溶液中，每天搖動3次。實驗過程中為避免灰塵及其它微生物的干擾，對使用材料均進行滅菌處理，且均在無菌條件下進行操作，繼續(xù)培養(yǎng)14d后，觀察其生長狀況并測定其生長指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 藻溶液銅綠微囊藻數(shù)量 采用顯微鏡計數(shù)法，取培養(yǎng)后的藻溶液1mL，稀釋20倍后用血球計數(shù)板計數(shù)測定銅綠微囊藻數(shù)量。每重復(fù)組取樣計數(shù)3次，取平均值作為該重復(fù)組樣品計數(shù)結(jié)果。

1.3.2 藻溶液相對電導(dǎo)率 取5mL混勻的藻溶液，在室溫下測定其電導(dǎo)值S1（DDS-12A型電導(dǎo)儀（上海）），再將上述試管置于水浴鍋加熱（100℃）30min，冷卻至室溫，測定其電導(dǎo)值S2，最后計算葉片相對電導(dǎo)率。計算公式為：

相對電導(dǎo)率（%）=S1/S2×100 [11] （1）

1.3.3 藻溶液葉綠素a含量 分別取各處理組藻溶液2mL分別置于10mL離心管中，于12000離心5min，用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL 80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55℃水浴放置30min，后于12000rpm離心5min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL，測定663nm處的光吸收值，測定結(jié)果按照CA=OD663/82，計算溶液葉綠素含量（mg/L）[6]。

1.3.4 藻溶液COD的測定 將經(jīng)過處理的微囊藻溶液進行40倍稀釋，并取20mL稀釋后的微囊藻溶液置于250mL磨口的回流錐形瓶中。通過重鉻酸鹽法（GB/T11914—1989）測定微囊藻培養(yǎng)液COD。

1.3.5 化感效應(yīng)評價 參照Williamson等的方法進行浸提物化感效應(yīng)評價[12]，即：

RI<0表明為抑制作用，RI>0表明為促進作用，絕對值的大小表示化感作用的強弱。

1.4 數(shù)據(jù)分析 本實驗中所有數(shù)據(jù)均使用Excel 2003整理，通過SPSS 17.0軟件進行LSD多重比較與單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 喜旱蓮子草浸提物對銅綠微囊藻數(shù)量的影響 由表1可知，與對照組相比，喜旱蓮子草浸提物對銅綠微囊藻數(shù)量具有顯著的化感抑制作用（P<0.05，RI<0），且各處理組之間具有顯著差異（P<0.05）。喜旱蓮子草地上部分浸提物使銅綠微囊藻數(shù)量降低50.55%～95.14%，而該植物地下部分浸提物使微囊藻數(shù)量降低36.95%～92.73%。通過化感效應(yīng)指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)喜旱蓮子草不同部位浸提物對銅綠微囊藻數(shù)量均具有明顯抑制作用，且抑制強度隨著喜旱蓮子草浸提物濃度的升高而增加。

2.2 喜旱蓮子草浸提物對藻溶液葉綠素a含量的影響 通過測定喜旱蓮子草浸提物處理的微囊藻溶液內(nèi)葉綠素a含量，表明不同部位浸提物對微囊藻溶液的葉綠素a含量有明顯影響作用（表2）。其中，喜旱蓮子草地上部分的浸提物在低濃度時（c≤70g/L）使微囊藻的葉綠素a增加64.24%～762.99%，而在高濃度時則使微囊藻的葉綠素a降低51.67%～60.03%。與對照相比，喜旱蓮子草地下部分的乙醇浸提物在較低濃度（c≤70g/L）時葉綠素含量增加19.41%～26.50%，較高濃度（c>70g/L）時微囊藻的葉綠素含量降低10.15%～75.94%。從化感效應(yīng)指數(shù)來看，喜旱蓮子草浸提物均在低濃度時促進了溶液葉綠素a含量的提高，而在高濃度處理條件下則表現(xiàn)為抑制作用。表明隨著該入侵植物浸提物濃度的增加，微囊藻溶液葉綠素a含量呈先降低后增加的趨勢。

2.3 喜旱蓮子草浸提液對微囊藻溶液相對電導(dǎo)率的影響 微囊藻溶液的相對電導(dǎo)率在浸提物濃度增加的過程中表現(xiàn)為逐漸降低（表3）。與對照相比，喜旱蓮子草地上部分浸提物使微囊藻的相對電導(dǎo)率增加2.92%～29.19%;而地下部分浸提物使微囊藻的相對電導(dǎo)率增加0.50%～11.82%。通過化感效應(yīng)指數(shù)，喜旱蓮子草不同部分乙醇浸提物相同濃度處理下，地上部分對微囊藻相對電導(dǎo)率的化感作用較強。

2.4 喜旱蓮子草浸提液對微囊藻溶液化學(xué)需氧量的影響 由表4可知，與對照組相比，隨著喜旱蓮子草地上部分乙醇浸提物濃度的增加，微囊藻溶液COD呈現(xiàn)先降低后增大的趨勢，而地下部分浸提物濃度的下降，使微囊藻溶液COD呈現(xiàn)降低的趨勢。各處理間相比，除喜旱蓮子草地上部分浸提物在最高濃度（280g/L）影響下微囊藻溶液COD增加了12.43%以外，而其他濃度處理（≤140g/L）使微囊藻溶液COD降低13.15%～66.84%。通過化感效應(yīng)分析表明，除地上部分在280g/L濃度處理時使溶液COD增加即表現(xiàn)為化感促進作用外，其余處理條件下均為化感抑制作用（RI<0）。

4 結(jié)論與討論

藻類數(shù)量的大小是最能反映藻類生長狀況的一個指標(biāo)[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)：喜旱蓮子草浸提物對溶液內(nèi)微囊藻數(shù)量具有明顯的抑制效應(yīng)，浸提物濃度越低，則微囊藻數(shù)量降低的幅度越大。這可能是由于浸提物中所含有的部分有機物達(dá)到一定濃度時，通過固定藻類細(xì)胞使其失去生命活力，也可通過降低藻類光合作用而抑制藻類生長最終殺滅藻類細(xì)胞[13]。另外，喜旱蓮子草浸提物的添加可能遮擋了微囊藻溶液的部分光照，導(dǎo)致實驗過程中光強下降，降低光合水平，從而對藻類生長產(chǎn)生抑制作用[14]。

葉綠素是光合作用的原料[15，16]，藻類葉綠素含量的高低直接反映出藻類生長中光合作用程度的高低。通過藻類抑制實驗，可作為評價受試物對藻類的“短期抑制效應(yīng)”的指標(biāo)[16]。而藻類進行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)葉綠素a表示光合作用的強弱，用于表征藻類的存活狀況及生物量的大小[17]。本實驗中，喜旱蓮子草浸提物在低濃度時增加微囊藻溶液葉綠素a含量，而在較高濃度時則會抑制葉綠素a的含量。這是由于當(dāng)喜旱蓮子草浸提物濃度增加到一定程度時，會產(chǎn)生聚集成團的現(xiàn)象，會超出藻細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)能力，造成葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，從而影響藻類生長[7]。該實驗中發(fā)現(xiàn)低濃度浸提物會促進藻類葉綠素a的含量，這可能是由于浸提物刺激了微囊藻體內(nèi)某些酶的活性，從而促進了藻類的生長[18]。

相對電導(dǎo)率是反應(yīng)細(xì)胞膜系統(tǒng)狀況的一個重要生理生化指標(biāo)[19]，往往在植物受到脅迫時，會導(dǎo)致相對電導(dǎo)率的變化。受環(huán)境脅迫越大，細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)等物質(zhì)滲漏，進而引起組織的電解率發(fā)生變化，從而電導(dǎo)率越大[20]。因此，藻類細(xì)胞膜通透性的增加可以作為衡量植物脅迫程度的指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)，喜旱蓮子草浸提物使微囊藻溶液的相對電導(dǎo)率顯著增加，這可能是由于藻類在逆境狀態(tài)下細(xì)胞膜容易受到損傷而破裂，進而導(dǎo)致細(xì)胞液外滲而增大相對電導(dǎo)率。

化學(xué)需氧量可以作為反應(yīng)水中還原物質(zhì)多少的一個指標(biāo)，水中主要的還原物質(zhì)為有機物、亞硝酸鹽、硫化物等?；瘜W(xué)需氧量越小，表明水污染程度越輕[21-22]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在喜旱蓮子草浸提物處理條件下微囊藻溶液的COD顯著下降，這可能是由于喜旱蓮子草浸提物影響藻類生長，從而降低了水中有機物的含量。

外來種一般都有較強的適應(yīng)性和寬廣的生態(tài)幅，從而能夠在入侵地生態(tài)系統(tǒng)中成功入侵[23-24]。目前的研究表明，石菖蒲、梭魚草、大薸等植物對銅綠微囊藻具有明顯化感效應(yīng)[17，19，25]，同時也發(fā)現(xiàn)喜旱蓮子草對不同植物也表現(xiàn)出明顯的化感作用[6，26]，這為探討該入侵植物的綜合利用與防治提供了很好的思路和切入點。本研究發(fā)現(xiàn)，喜旱蓮子草浸提物對銅綠微囊藻具有一定的化感抑制作用，但該入侵植物的化感物質(zhì)是否能夠成為防治藍(lán)藻的有效措施，還需要進一步深入分析化感抑制作用的活性物質(zhì)及其作用機制，從而更好地為喜旱蓮子草的綜合利用以及藍(lán)藻的生態(tài)控制提供理論支持。

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（責(zé)編：張宏民）