水曲柳FmWRKY44基因克隆及表達分析

李新宇 何利明 詹亞光,2*

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

WRKYs轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子家族，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中共發(fā)現(xiàn)了74個基因[1]，在水稻(Oryzasativa)中有109個成員[2]。每個WRKY轉錄因子的DNA結合域中都至少含有一個WRKY結構域，該結構域是一段大約60個氨基酸所組成的多肽序列，在其氨基(N)末端含有由WRKYGQK7個氨基酸組成的保守結構域。在其羧基(C)末端有一個鋅指結構[3～4]。根據(jù)WRKY結構域的數(shù)目和其鋅指結構的組成可以將WRKY家族分為3個亞家族。第一類(Ⅰ)一般含有2個WRKY結構域，但只有C末端行使功能，N段的WRKY結構域輔助C端的結構域行使作用。其鋅指結構的組成為CX4-5CX22-23HXH(X為非保守氨基酸)。第二類(Ⅱ)只含有1個WRKY結構域，其鋅指結構仍為CX4-5CX22-23HX1H。第三類(Ⅲ)也只含有1個WRKY結構域。但其鋅指結構發(fā)生了改變，為CX7CX23HX1C。不同的WRKY亞家族有著不同的與DNA的結合能力，在進化上也是從第一類亞家族進化到第二、三類亞家族[5～7]。

轉錄調(diào)控是通過細胞或生物有機體來控制基因表達的重要機制。WRKY轉錄因子作為植物中最大的轉錄因子家族之一，在調(diào)控植物應對非生物脅迫的響應中起重要作用[8]。最近研究中，過表達的轉ZmWRKY106基因玉米植株提高了對干旱和高溫脅迫的耐受性[9]，菊花DgWRKY2基因可以增強其對鹽脅迫的耐受性[10]，虎杖PcWRKY33可以增加細胞的活性氧(ROS)水平來降低耐鹽性[11]，水稻OsWRKY71應對冷害脅迫中起重調(diào)控作用[12]，黃瓜CsWRKY46通過ABA信號使轉基因植株抗寒[13]。最新研究還顯示擬南芥轉錄因子AtWKRY13能激活PDR8表達正向調(diào)節(jié)其對鎘的抗性[14]。同時大量的研究表明，WRKY轉錄因子不僅參與植物對非生物脅迫的應答，同時也參與調(diào)控植物的激素信號通路以及生長發(fā)育。如轉錄因子WRKY18、WRKY40和WRKY60參與擬南芥對ABA信號的響應[15]。AtWRKY39可以被SA或MeJA誘導[16]，并協(xié)同參與SA和JA信號通路，基因OsWRKY24，OsWRKY53和OsWRKY70對劑量依賴性調(diào)節(jié)GA和ABA信號傳導的負轉錄調(diào)節(jié)劑起作用[17]，AtWRKY75可以調(diào)節(jié)DELLA蛋白促進擬南芥開花[18]。

水曲柳是我國東北地區(qū)主要的造林樹種和品質(zhì)優(yōu)良的用材樹種，能在-40℃下存活，在抗寒方面有著優(yōu)良的基因資源[19]，在改良植物抗寒性的基因工程的應用上有巨大潛力。目前，關于水曲柳基因報道較少，對抗逆相關的WRKYs轉錄因子的報道也僅有一例[20]。為此，本研究從水曲柳轉錄組中克隆了FmWKRY44基因，對其進行了生物信息學分析，探索了該基因在不同組織中以及不同激素和非生物脅迫下的表達特點，為水曲柳抗寒基因資源的利用奠定了一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

Takara植物RNA提取試劑盒(9767)，Takara LATaq(RR02MQ)，Takara DL2000 Marker，全式金反轉錄試劑盒(AH311)，全式金定量反轉錄試劑盒(AH341)，Takara SYBR Green定量試劑盒(RR802A)，OMEGA瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取與反轉錄

使用Takara植物RNA提取試劑盒(9767)提取水曲柳葉片總RNA。用1%瓊脂糖檢測所提取RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。使用全式金反轉錄試劑盒(AH311)進行cDNA第一鏈合成。

1.2.2 引物設計及目的基因克隆

參照水曲柳基因轉錄組序列，設計FmWRKY44基因特異性引物(FmWRKY44-F：5′-TTTGCCTTCGACACTTCTCA-3′，F(xiàn)mWRKY44-R：5′-GGAAGTCAGTTCCTTGAGTGT-3′)。進行PCR反應，擴增目的基因，反應體系：10×LATaqBufferⅡ 2 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1each)1.6 μL，F(xiàn)mWRKY44-F(10 pmol·μL-1)1 μL，F(xiàn)mWRKY44-R(10 pmol·μL-1)1 μL，水曲柳cDNA 1 μL，LATaq(5 units·μL-1)0.4 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確認目的條帶后，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，并用瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物鏈接pEASY-T5載體，轉入大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜，選取陽性結果菌液，送至上海生物工程有限公司測序驗證。

1.2.3 FmWRKY44的生物信息學分析

運用NCBI ORF Finder在線軟件分析查找基因的開放閱讀框。利用DNAMAN軟件對因的cDNA序列進行分析，并推測得到其蛋白質(zhì)編碼氨基酸序列。使用在線分析軟件Protparain對蛋白的理化性質(zhì)進行分析。使用在線分析軟件ProtScale對蛋白進行親水性/疏水性分析。使用在線分析工具SignalP的神經(jīng)網(wǎng)絡算法對蛋白進行信號肽的預測和分析。使用在線工具TMPred對蛋白的跨膜結構進行預測和分析。利用SOPMA在線工具分析蛋白的二級結構組成。與NCBI上其他物種同源蛋白序列進行比對分析，然后使用MEGA7軟件，構建進化樹。使用在線多序列比對軟件PRALINE(http://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/)對蛋白與其它不同物種中同源蛋白序列進行詳細的多序列比對分析。使用SMART在線分析軟件對WRKY44蛋白的保守結構域進行預測。

1.2.4 實驗材料及處理

本研究所用的組織材料為本實驗室培養(yǎng)的水曲柳愈傷組織和水曲柳種子組培培養(yǎng)30 d的幼苗。根、莖、葉取自水曲柳3年生盆栽苗。按照表1中處理方法對實驗材料進行處理。

表1 實驗材料處理方法及處理時間

1.2.5 實時熒光定量分析

以水曲柳種子、愈傷組織、根、莖、葉和組培苗作為材料，應用RNA提取試劑盒(minibest，9769)提取總RNA。應用全式金qRT-PCR試劑盒(AH341)將RNA反轉錄為cDNA。以F:5′-GGGAGGGACAACCTTATTCG-3′;R:5′-CCTTTGACTTGCTTCTGACCAT-3′為FmWRKY44引物，以FmTu(F:5′-AGGACGCTGCCAACAACTTT-3′;R:5′-TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG-3′)為內(nèi)參基因。采用ABI PRISM7500實時熒光定量系統(tǒng)進行基因表達分析。反應體系：模板cDNA 1 μL(10 ng·μL-1)，2×SYBR Premix ExTaq10 μL,Rox reference DyeⅡ 0.4 μL,primer F 0.8 μL,primer R 0.8 μL,加水補足至20 μL。反應程序：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，計算FmWRKY44基因相對表達量。每個取樣點設置3次生物學重復，qRT-PCR設置3次技術重復。

圖1 FmWRKY44基因的RT-PCR擴增電泳結果 M.DL2000 DNA maker；1.FmWRKY44基因Fig.1 RT-PCR amplification electrophoresis results of FmWRKY44 gene M.DL2000 DNA maker；1.FmWRKY44 gene PCR product

2 結果與分析

2.1 FmWRKY44基因克隆與序列分析

以水曲柳葉片為模板，通過RT-PCR擴增獲得一條長為1 383 bp的序列(圖1)。經(jīng)BLAST比對分析，該序列與樟子松WRKY基因(XM_023033499.1)一致性為91%。經(jīng)DNAMAN翻譯，該序列編碼460個氨基酸。通過在線分析軟件SMART對FmWRKY44蛋白分析，并繪制其結構域的位置圖。結果表明，F(xiàn)mWRKY44在185～243位置和381～440位置共有兩個WKRY保守結構域。所以推測其屬于WRKY家族中的Ⅰ類蛋白質(zhì)亞家族(圖2)。

圖2 FmWRKY44基因編碼區(qū)的核苷酸序列及其推導氨基酸序列 下橫線表示W(wǎng)RKY超家族結構域。Fig.2 Nucleotide sequence of the coding region of FmWRKY44 gene and its deduced amino acid sequence The lower horizontal line indicates the WRKY superfamily domain.

2.2 FmWRKY44編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1 FmWRKY44蛋白一級結構分析

利用ProtParam工具在線分析，F(xiàn)mWRKY44編碼460個氨基酸，分子式為C2190H3477N645O717S15，相對分子質(zhì)量50.80 kD，等電點(pI)8.88，不穩(wěn)定系數(shù)38.62，為穩(wěn)定蛋白，平均親水系數(shù)(GRAVY)-0.878，為親水蛋白。利用ProtScale計算FmWRKY44親疏水性圖譜，結果顯示FmWRKY44蛋白中疏水氨基酸占20.4%，親水氨基酸占87.4%，親水區(qū)域分布面廣，所占比高；疏水區(qū)域較少，所占比低。表明FmWRKY44蛋白為親水蛋白(圖3A)。利用SignalP4.1 Server和TMPred分析預測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mWRKY44沒有跨膜結構區(qū)域(圖3B)，未發(fā)現(xiàn)信號肽結構，推斷該蛋白為非分泌蛋白，表明蛋白在細胞質(zhì)中合成后不能被轉運。利用WOLFPSORT預測FmWRKY44亞細胞定位，結果表明，F(xiàn)mWRKY44主要分布在細胞核中，占78.3%，細胞質(zhì)、線粒體和過氧化物酶體分別占8.7%、8.7%和4.3%。

2.2.2 FmWRKY44蛋白的二級結構預測

利用SOPMA在線工具分析FmWRKY44蛋白的二級結構組成，結果顯示蛋白二級結構主要由70.22%(323aa)的無規(guī)則卷曲，16.30%(77aa)的α螺旋結構(Alpha helix)，10.22%(47aa)的擴展長鏈(Extended strand)，3.26%(15aa)的β轉角結構(Beta bridge)構成(圖4)。

2.2.3 FmWRKY44蛋白的活性位點分析

利用PROSCAN在線分析工具對FmWRKY44蛋白進行活性位點分析，結果表明該蛋白包括4個N-糖基化位點，6個蛋白激酶C磷酸化位點，10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，4個N-豆蔻?；稽c。

圖3 水曲柳FmWRKY44蛋白的親/疏水性(A)、跨膜區(qū)域(B)分析預測Fig.3 Analysis of pro-/hydrophobic(A) and transmembrane region(B) of FmWRKY44 protein

圖4 水曲柳FmWRKY44蛋白的二級結構預測 橫軸表示氨基酸位置；藍色表示α螺旋；綠色表示β轉角；紫色表示無規(guī)則卷曲；紅色標會延伸鏈Fig.4 Prediction of secondary structure of FmWRKY44 protein The horizontal axis represents the amino acid position; the blue represents the alpha helix; the green represents the beta turn; the purple represents the random curl; the red marker extends the chain

圖5 不同植物WRKY44蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of WRKY44 from different plants

2.2.4 FmWRKY44蛋白的系統(tǒng)進化分析

采用MEGA7.0.2中的NJ方法構建蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示數(shù)水曲柳FmWRKY44與芝麻SiWRKY44[21]親緣關系較近(圖5)。

2.3 FmWRKY44同源蛋白的多序列比對分析結果

利用在線多序列比對軟件PRALINE對FmWRKY44蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中一些其它物種的WRKY44蛋白序列進行同源性比較，結果表明，F(xiàn)mWRKY44與其它WRKY44蛋白序列的保守區(qū)主要集中在2個WRKY結構域，其鋅指結構為CX4～5CX22～23HXH(X為非保守氨基酸)，與前人研究相符合(圖6)。

2.4 FmWRKY44的表達特性

以水曲柳種子、葉、葉柄、根、莖和愈傷分別為模板，通過qRT-PCR檢測分析FmWKRY44在水曲柳不同部位的相對表達量。結果顯示FmWKRY44在種子中高度表達，是葉片表達量的4.83倍(圖7A)。

為了分析水曲柳FmWRKY44對非生物脅迫的表達模式，我們分析了低溫、高溫、100 mmol·L-1NaCl和10%PEG-6000逆境條件下FmWKRY44的表達情況。在低溫脅迫下FmWRKY44基因表達量在0～12 h基本持平，在24 h達到最高，為0 h表達量的2.61倍，隨后表達量降低，在96 h達到最低，為0 h表達量的0.41倍(圖7B)。在高溫脅迫下，F(xiàn)mWRKY44表達量在0.5 h時立即下降，其表達量為0 h表達量的0.23倍，隨后1～2 h內(nèi)逐漸上升(圖7C)。在NaCl鹽脅迫下，F(xiàn)mWRKY44在0～6 h內(nèi)基因表達量呈現(xiàn)先上升在下降的趨勢，3 h表達量達到最高并為0 h表達量的1.78倍，12 h基因表達量恢復并持平(圖7D)。PEG模擬干旱處理下，F(xiàn)mWRKY44基因表達量在12和72 h出現(xiàn)峰值分別是0 h表達量的1.98和1.66倍，其他時間較0 h表達量降低(圖7E)。由此，F(xiàn)mWRKY44基因可以參與低溫、高溫、高鹽以及干旱非生物脅迫影響的響應，且高度響應低溫、高溫逆境。

為了分析水曲柳FmWRKY44對不同激素的響應情況，我們用激素NAA、ABA、GA3、JA處理水曲柳實生苗分析其FmWRKY44基因表達情況。結果顯示，在NAA處理下FmWKRY44基因表達量在0～24 h內(nèi)FmWRKY44基因表達量降低，在6 h達到最低峰值，其表達量是0 h表達量的0.29倍，在72 h是表達量升高并達到最高峰值，為0 h表達量的2.08倍(圖7F)。ABA處理下FmWRKY44基因表達量在13和12 h出現(xiàn)峰值分別是0 h表達量的1.96和1.65倍，其他時間較0 h表達量降低(圖7G)。GA3處理下前1～6 h內(nèi)FmWRKY44基因表達量降低，12～72 h表達量逐漸升高，72 h達到峰值，其表達量是0 h表達量的1.3倍(圖7H)。JA處理下FmWRKY44基因表達量在1～24 h較低，在72 h時表達升高并達到最高峰值，其表達量是0 h表達量的1.64倍(圖7I)。因此，F(xiàn)mWRKY44基因可以響應NAA、ABA、GA3、JA信號。

圖6 FmWRKY44與其它植物WRKY蛋白序列比對 粗線表示W(wǎng)RKY結構域；箭頭表示鋅指結構Fig.6 Multiple-alignment of FmWRKY44 with other WRKY proteins Thick lines indicate WRKY domains;Arrows indicate zinc finger structures

圖7 水曲柳不同組織及不同處理下FmWRKY44表達分析 A.不同組織部位；B.低溫處理；C.高溫處理；D.NaCl處理；E.PEG處理；F.NAA處理；G.ABA處理；H.GA3處理；I.JA處理Fig.7 Expression analysis of FmWRKY44 in different tissues and different treatments A. Different tissue parts; B. Low temperature treatment; C. High temperature treatment; D. NaCl treatment; E. PEG treatment; F. NAA treatment; G. ABA treatment; H. GA3 treatment; I. JA treatment

3 討論

干旱、高鹽、低溫、高溫等極端條件，是植物生長過程中所面臨的的主要逆境非生物脅迫因素。在逆境條件下，許多植物所特有的轉錄因子家族如WRKY、AP2/ERF和NAC等，它們在植物的生長抗逆調(diào)節(jié)控制中起著重要而獨特的作用。WRKY轉錄因子是其中發(fā)現(xiàn)較早的一種轉錄因子，其主要結構是所包含的WRKY結構域[22]，是具有60個氨基酸長的DNA結合結構域，特征在于N端具有一個高度保守的WRKYGQK核心基序，根據(jù)WRKY結構域的數(shù)目和鋅指結構的類型[8,23]，可以區(qū)分WRKY轉錄因子的類型。本研究獲得FmWRKY44基因，發(fā)現(xiàn)該基因含有2個WRKY保守結構域，且鋅指結構符合CX4-5CX22-23HXH結構，通過保守域和與其他物種WRKY44蛋白序列比較分析證明該基因屬于第一類WRKY家族。

在植物脅迫反應中，WRKY蛋白促進了植物復雜信號網(wǎng)絡的建立和在植物非生物脅迫反應中重要作用的WRKY蛋白使?jié)撛诘幕虬l(fā)揮傳遞逆境脅迫的作用[24～25]。先前研究發(fā)現(xiàn)植物受到逆境脅迫時，胞外信號MAPK激酶等逐級傳遞調(diào)控信號進入胞內(nèi)，激活WRKY及其他轉錄因子與下游靶基因結合[26～27]，并在ABA、SA、JA、ET以及其他WRKY轉錄因子等信號途徑的調(diào)控下，在轉錄水平上促進該基因的表達，從而影響植物非生物脅迫應答[28]。本研究通過測定30天組培苗在低溫、高溫、鹽和干旱條件下的基因表達量，分析發(fā)現(xiàn)FmWRKY44可以受到溫度調(diào)節(jié)，并低溫促進其表達，高溫抑制其表達FmWRKY44，并對鹽、干旱脅迫也有劇烈響應。植物內(nèi)源激素如ABA、SA、JA、ET等不僅參與脅迫反應，而且還在植物生長發(fā)育、種子發(fā)育及衰老等一系列生命活動期中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。所以我們進一步測定了FmWRKY44在NAA、ABA、GA3、JA處理下的表達水平。分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mWRKY44在NAA、GA3和JA處理下都基本呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，說明FmWRKY44可能受3種激素負向調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)FmWRKY44在種子中的表達水平，遠高于在其他器官中的表達水平是其在葉片表達量的4.83倍，說明FmWRKY44積累對于種子萌發(fā)與休眠過程起到重要作用。此外，ABA信號對種子萌發(fā)，以及應對干旱等非生物脅迫有著重要作用?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)許多WRKY轉錄因子如AtWKRY43[29]、ZmWRKY40[30]均響應ABA信號，進而調(diào)控種子萌發(fā)和應對高鹽、干旱和低溫脅迫。AtWRKY44在干旱脅迫下受GI-miRNA172信號響應，并進一步實驗分析認為其響應過程可能是干旱使得ABA水平增加，進而激活級聯(lián)響應[31]。在本研究中FmWKRY44對ABA、干旱、鹽、低溫以及種子萌發(fā)過程中均有劇烈響應，說明其可能也參與ABA信號通路，但其具體作用機制仍不明確，仍需未來進行實驗驗證及討論分析。