吸入法建立急性一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病大鼠模型

陳超　王寶軍　項(xiàng)文平　李月春　郝喜娃　龐江霞　高浩然　?謝偉

[摘要] 目的 建立符合臨床特點(diǎn)的大鼠急性一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病（DEACMP）模型。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將認(rèn)知功能篩查合格的雄性Wistar大鼠196只分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組164只，對照組32只。對照組吸入空氣，實(shí)驗(yàn)組吸入一氧化碳（CO）氣體，根據(jù)吸入CO濃度不同分為三組，分別為1000、3000、4000 ppm組，每組存活32只，連續(xù)吸入CO 40 min保持中毒濃度穩(wěn)定;各組大鼠分別在中毒后7、14、21和28 d處死大鼠取材;采用分光光度計(jì)分析碳氧血紅蛋白（COHb）水平;采用水迷宮訓(xùn)練評估各組大鼠中毒后認(rèn)知功能的變化情況，采用HE染色方法觀察大鼠海馬細(xì)胞受損情況，明確建立可靠的大鼠DEACMP模型的方法。 結(jié)果 吸入CO后大鼠出現(xiàn)明顯中毒表現(xiàn)，COHb水平與吸入CO濃度大小呈正相關(guān)（r = 0.748，P < 0.05），1000、3000、4000 ppm組及對照組大鼠死亡率分別為0%、40.74%、58.97%、0%，各組大鼠DEACMP發(fā)生率分別為6.25%、28.13%、31.25%、0%，在中毒后21、28 d大鼠DEACMP高發(fā)，選擇死亡率低、發(fā)病率高、并結(jié)合大鼠飼養(yǎng)周期，明確大鼠吸入CO濃度3000 ppm，中毒后21 d可以建立DEACMP大鼠模型。 結(jié)論 大鼠吸入CO濃度3000 ppm 40 min，21 d后可以建立可靠DEACMP模型，為DEACMP的預(yù)防和治療帶來新的希望。

[關(guān)鍵詞] 一氧化碳中毒;動物模型;遲發(fā)型腦病

[中圖分類號] R74 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（c）-0004-04

[Abstract] Objective To establish a model of delayed encephalopathy acute carbon monoxide poisoning （DEACMP）. Methods A total of 196 intelligence-qualified rats were divided into experimental group and control group by random number table method， with 164 rats in the experimental group and 32 rats in the control group. The experimental group used an acute static inhalation of carbon monoxide （CO） to establish a poisoned rat model. According to different concentrations of CO poisoning， they were randomly divided into 1000， 3000， 4000 ppm group， with 32 rats alive in each group. Each group continued to inhale for 40 minutes. Rats in each group were sacrificed at 7， 14， 21 and 28 d after poisoning. Spectrophotometer method was used to dynamically monitor the changes of carboxyhemoglobin （COHb） content in each group. Morris water maze test was used to evaluate cognitive function. HE staining was used to observe the cell damage in hippocampus. The best poisoning concentration and time for establishing a DEACMP rat model was established. Results After poisoned by CO， the rats showed typical symptoms of poisoning. There was a significant positive correlation between COHb content and CO concentration （r = 0.748， P < 0.05）. The mortality rates of the 1000， 3000， 4000 ppm group and the control group were 0%， 40.74%， 58.97% and 0%， respectively. The incidence of DEACMP in each group was 0%， 6.25%， 28.13%， 31.25%， and 0%， and the 21 d and 28 d after being poisoned were high DEACMP time points. Based on the low mortality rate and high incidence rate， the CO poisoning concentration of 3000 ppm and the time of 21d were the best method to establish a DEACMP rat model. Conclusion A DEACMP rat model can be established with a static inhalation concentration of 3000 ppm CO for 40 minutes， and models can be successfully established 21 days after poisoning.

[Key words] Carbon monoxide poisoning; Animal model; Delayed encephalopathy

CO中毒是常見的窒息性中毒之一，廣泛存在于人們生產(chǎn)生活環(huán)境中，當(dāng)空氣中CO濃度超過35 ppm即可出現(xiàn)中毒癥狀[1-3]，中毒可引起多個臟器功能損害[4]，一氧化碳中毒遲發(fā)型腦?。╠elayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）是其中較常見的并發(fā)癥[5]，發(fā)病率為0.2%～47.3%[6]，其臨床表現(xiàn)較重，以認(rèn)知障礙為主，致殘率較高，給患者生活帶來嚴(yán)重影響[7]。目前對于DEACMP的發(fā)病機(jī)制及治療雖然已有大量研究，但仍不能合理闡明，成功建立動物模型是進(jìn)一步研究DEACMP的基礎(chǔ)，將有助于闡明其發(fā)生過程，為臨床預(yù)防與治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性的Wistar大鼠共208只，購自內(nèi)蒙古大學(xué)動物研究培育中心，大鼠體重180～230 g，飼養(yǎng)于室溫18～23℃且12 h明暗交替的室內(nèi)，自由進(jìn)食水。

1.2 主要儀器與試劑

動物CO中毒箱，自行設(shè)計(jì)，用鋼化玻璃制成的體積為0.7 m×0.5 m×0.43 m的長方體，使用膠粘劑封閉中毒箱連接處，箱體分別設(shè)置進(jìn)氣口、出氣口及CO濃度檢測儀連接處;CO氣體濃度檢測儀，購自金盾安全防護(hù)有限公司及元特科技有限公司;Morris水迷宮及圖像自動監(jiān)視系統(tǒng);Leica CM1950冰凍切片機(jī);T6新悅-可見分光光度計(jì);CO標(biāo)準(zhǔn)氣體，購自佛山市科的氣體有限公司。

1.3 動物訓(xùn)練

首先將大鼠放置在水迷宮平臺上數(shù)秒熟悉環(huán)境，隨后依次在4個象限進(jìn)行訓(xùn)練，電腦自動記錄大鼠運(yùn)動軌跡和找到平臺時間。訓(xùn)練5 d后選擇逃避潛伏期<60 s，運(yùn)動軌跡為直線式或趨向式的大鼠為合格，不合格者淘汰。

1.4 模型建立及分組情況

隨機(jī)將196只訓(xùn)練合格的大鼠分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組164只，對照組32只，實(shí)驗(yàn)組給予急性靜態(tài)吸入CO氣體建立中毒模型[8-9]，依據(jù)CO中毒濃度不同分為三組，即1000、3000及4000 ppm組，連續(xù)吸入CO 40 min保持中毒濃度穩(wěn)定;對照組通入等量的空氣，其他條件不變。因CO濃度不同大鼠死亡情況不同，為保證后期實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行，中毒后每組各需要存活大鼠32只，隨后將其分別隨機(jī)分為四個時間點(diǎn)，即中毒后7、14、21和28 d處死大鼠取材，共計(jì)16組，每組各8只。

1.5 碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，COHb）含量檢測

分別在中毒后15、30、60、120和240 min，斷尾取大鼠血，采用改良雙波長定量法檢測COHb含量，按照公式計(jì)算：COHb（%）=（2.44×A535/A578-2.68）×100%。

1.6 DEACMP模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)

各組大鼠分別于中毒后4個時間點(diǎn)行水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠運(yùn)動軌跡和逃避潛伏期，大鼠常規(guī)多聚甲醛心臟灌注固定后取腦行病理學(xué)觀察。參考Ochi等[10]研究結(jié)果判斷DEACMP模型是否成功：水迷宮結(jié)果提示大鼠認(rèn)知功能發(fā)生障礙，并且HE染色發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)海馬組織細(xì)胞受損。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson法進(jìn)行單因素相關(guān)性分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠CO中毒后表現(xiàn)

向中毒箱通入CO氣體5～10 min后大鼠開始出現(xiàn)多動、表現(xiàn)活躍，15～20 min后出現(xiàn)癱軟無力、活動減少、不能站起、呼吸淺快，口周、耳部、肢端皮膚呈櫻桃紅色，3000 ppm及4000 ppm組大鼠中毒癥狀較重，部分發(fā)生抽搐、角弓反張、昏迷甚至死亡。解剖死亡大鼠發(fā)現(xiàn)多臟器充血伴局部點(diǎn)片狀出血;腦組織高度充血，周圍間質(zhì)水腫，部分出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，與報道急性CO中毒表現(xiàn)相符。

2.2 中毒后大鼠COHb含量變化

中毒箱中通入CO 15 min后測得各組大鼠COHb含量均升高，1000 ppm組COHb含量16.32%～22.92%，3000 ppm及4000 ppm組32.13%～75.65%，符合中、重度中毒標(biāo)準(zhǔn)，中毒后15 min測得COHb含量與吸入CO濃度大小呈正相關(guān)（r = 0.748，P < 0.05），見圖1，COHb含量隨時間變化情況見圖2。

2.3 各組大鼠死亡情況比較

對照組及1000 ppm組大鼠在中毒過程中無死亡情況發(fā)生;3000 ppm組、4000 ppm組大鼠死亡多發(fā)生在中毒30～40 min。3000、4000 ppm組大鼠死亡率分別為為40.74%（22/54）、58.97%（46/78），對照組、1000 ppm組大鼠死亡率均為0%，實(shí)驗(yàn)組各組間死亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.4 DEACMP發(fā)生情況

2.4.1 水迷宮結(jié)果 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1000 ppm組大鼠各時間點(diǎn)逃避潛伏期與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;3000 ppm及4000 ppm組大鼠在中毒后21、28 d與對照組、1000 ppm組比較逃避潛伏期明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與中毒前比較，3000 ppm及4000 ppm組大鼠在中毒后21、28 d逃避潛伏期明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（表1、圖3）。

2.4.2 病理學(xué)結(jié)果 ?對照組大鼠海馬組織細(xì)胞形態(tài)正常、細(xì)胞核、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整清晰，3000 ppm組及4000 ppm組大鼠部分可見海馬組織細(xì)胞排列稀疏、細(xì)胞萎縮、數(shù)量減少、大小不等、結(jié)構(gòu)模糊不清，未發(fā)現(xiàn)明顯壞死灶，見圖4。

結(jié)合以上水迷宮與病理結(jié)果，判斷各組大鼠DEACMP發(fā)生情況，對照組、1000 ppm組、3000 ppm組及4000 ppm組DEACMP的發(fā)生率分別為0（0/32）、6.25%（2/32）、28.13%（9/32）、31.25%（10/32）;3000 ppm組與4000 ppm組DEACMP發(fā)生率比1000 ppm組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;3000 ppm組與4000 ppm組之間DEACMP發(fā)病率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;1000 ppm組大鼠在中毒后28 d有2只發(fā)生DEACMP，3000 ppm組在14 d有1只發(fā)病，在21、28 d均有4只發(fā)病，4000 ppm組在7、14 d分別有1只發(fā)病，在21、28 d分別有5只和3只發(fā)病，DEACMP在3000 ppm組與4000 ppm組中毒后21、28 d高發(fā)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），相同濃度在21、28 d之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），結(jié)合大鼠飼養(yǎng)周期，選擇死亡率低、發(fā)病率高的組別，明確大鼠吸入CO濃度3000 ppm、時間21 d可以建立可靠的DEACMP動物模型。

3 討論

DEACMP患者常出現(xiàn)神經(jīng)精神異常（智能、人格、行為等改變），病程較長，治療困難，常遺留精神或認(rèn)知障礙[11-12]，這是目前臨床工作中亟待解決的難題，深入研究DEACMP的基礎(chǔ)是建立可靠的動物模型，本課題在Hara等[8-9]研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗(yàn)證和改進(jìn)，使實(shí)驗(yàn)更加安全、結(jié)果更加可靠。與腹腔注射CO比較[13]，吸入法與日常中毒情況更接近，代表性更好;中毒時氣體通過密封性良好的管道進(jìn)入中毒箱，實(shí)驗(yàn)人員不易發(fā)生意外中毒，安全性較高;但吸入法存在隨著中毒時間延長，中毒箱內(nèi)氧氣減少、二氧化碳潴留等情況，為了改善這些情況對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究采用每次減少中毒大鼠只數(shù)，來增加實(shí)驗(yàn)的可靠性。

COHb含量高低是判斷CO中毒嚴(yán)重程度的重要方法之一，相關(guān)研究[14-15]發(fā)現(xiàn)是否發(fā)生DEACMP與中毒的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)DEACMP在3000 ppm組及4000 ppm組中發(fā)生率較高，且兩組COHb含量可達(dá)中、重度中毒標(biāo)準(zhǔn)，說明中毒程度直接影響DEACMP的發(fā)生，該研究結(jié)果與相關(guān)研究[14-15]結(jié)果相符;中毒后15 min COHb含量與吸入CO濃度呈正相關(guān)，與Li等[15]研究結(jié)果一致，提示本研究建立的DEACMP模型可靠。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是反映認(rèn)知功能變化較好的實(shí)驗(yàn)方法之一，其結(jié)果準(zhǔn)確可信，是判斷動物認(rèn)知功能的重要方法[16-17]。實(shí)驗(yàn)前期首先通過水迷宮訓(xùn)練篩選出智力、運(yùn)動功能正常的大鼠，淘汰了學(xué)習(xí)記憶不合格大鼠，避免了動物之間個體差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠和準(zhǔn)確。本研究水迷宮結(jié)果顯示，3000 ppm組及4000 ppm組大鼠逃避潛伏期在中毒后21、28 d較對照組明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說明在中毒后21、28 d兩組大鼠認(rèn)知功能發(fā)生改變。相關(guān)研究[18-20]發(fā)現(xiàn)CO中毒后腦內(nèi)海馬組織細(xì)胞廣泛損害，病理學(xué)表現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清、層數(shù)變薄、體積縮小等，本實(shí)驗(yàn)HE染色發(fā)現(xiàn)DEACMP大鼠海馬組織細(xì)胞排列稀疏、細(xì)胞萎縮、數(shù)量減少、大小不等、結(jié)構(gòu)模糊不清，說明中毒后大鼠海馬組織細(xì)胞存在損傷。根據(jù)病理學(xué)及水迷宮結(jié)果共同判定大鼠吸入CO濃度3000 ppm、時間21 d可以建立可靠的DEACMP模型，為DEACMP發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠基礎(chǔ)，為DEACMP的預(yù)防與治療帶來新的希望。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?Rose JJ，Wang L，Xu Q，et al. Carbon monoxide poisoning：pathogenesis，management，and future directions of therapy [J]. Am J Respir Crit Care Med，2017，195（5）：596-606.

[2] ?Borger J. The danger of carbon monoxide poisoning associated with hookah use：an emergency physician′s perspective [J]. N C Med J，2017，78（6）：424.

[3] ?McKenzie LB，Roberts KJ，Shields WC，et al. Distribution and Evaluation of a Carbon Monoxide Detector Intervention in Two Settings：Emergency Department and Urban Community [J]. J Environ Health，2017，79（9）：24-30.

[4] ?Wang B，Xiang W，Xue H，et al. Efficacy of N-Butylphthalide and hyperbaric oxygen therapy on cognitive dysfunction in patients with delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Med Sci Monit，2017， 23：1501-1506.

[5] ?Jorge A. Carbon monoxide poisoning [J]. Crit Care Clin，2012， 28：537-548.

[6] ?Goldstein M. Carbon monoxide poisoning [J]. J Emerg Nurs，2008，34：538-542.

[7] ?Xiang W，Xue H，Wang B，et al. Combined application of dexame-thasone and hyperbaric oxygen therapy yields better efficacy for patients with delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Drug Des Devel Ther，2017，11：513-519.

[8] ?Hara S，Mizukami H，Kurosaki K，et al. Existence of a threshold for hydroxyl radical generation independent of hypoxia in rat striatum during carbon monoxide poisoning [J]. Arch Toxicol，2011，85：1091-1099.

[9] ?Hara S，Mizukami H，Kuriiwa F，et al. cAMP production mediated through P2Y（11）-like receptors in rat striatum due to severe，but not moderate，carbon monoxide poisoning [J]. Toxicology，2011，288：49-55.

[10] ?Ochi S，Abe M，Li C，et al. The nicotinic cholinergic system is affected in rats with delayed carbon monoxide encephalopathy [J]. Neurosci Lett，2014，569：33-37.

[11] ?Sun X，Xu H，Meng X，et al. Potential use of hyperoxygenated solution as a treatment strategy for carbon monoxide poisoning [J]. PLoS One，2013，8（12）：e81779.

[12] ?Guan L，Zhang YL，Li ZY，et al. Salvianolic acids attenuate rat hippocampal injury after acute CO poisoning by improving blood flow properties [J]. Biomed Res Int，2015，2015：526483.

[13] ?Xiang WP，Xue H，Wang BJ，et al. Delayed encephalopathy of acute carbon monoxide intoxication in rats：potential mechanism and intervention of dexamethasone [J]. Pak J Pharm Sci，2014，27：2025-2028.

[14] ?Chen Q，Bai J，Li CR，et al. Changes of HbCO in the blood of rats with different CO concentration and inhalation time [J]. Fa Yi Xue Za Zhi，2016，32（6）：410-412.

[15] ?Li Q，Bi MJ，Bi WK，et al. Edaravone attenuates brain damage in rats after acute CO poisoning through inhibiting apoptosis and oxidative stress [J]. Environ Toxicol，2016，31（3）：372-379.

[16] ?Roderique JD，Josef CS，Newcomb AH，et al. Preclinical evaluation of injectable reduced hydroxocobalamin as an antidote to acute carbon monoxide poisoning [J]. J Trauma Acute Care Surg，2015，79：116-120.

[17] ?Zhang J，Wu H，Zhao Y，et al. Therapeutic effects of hydrogen sulfide in treating delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning [J]. Am J Ther，2016， 23（6）：e1709-e1714.

[18] ?Li HM，Shi YL，Wen D，et al. A novel effective chemical hemin for the treatment of acute carbon monoxide poisoning in mice [J]. Exp Ther Med，2017，14（5）：5186-5192.

[19] ?Xue L，Wang WL，Li Y，et al. Effects of hyperbaric oxygen on hippocampal neuronal apoptosis in rats with acute carbon monoxide poisoning [J]. Undersea Hyperb Med，2017，44（2）：121-131.

[20] ?Watanabe S，Matsuo H，Kobayashi Y，et al. Transient degradation of myelin basic protein in the rat hippocampus following acute carbon monoxide poisoning [J]. Neurosci Res，2010，68（3）：232-240.

（收稿日期：2018-01-24 ?本文編輯：金 ? 虹）