miRNA及其相關(guān)SNP在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中作用的研究概況

楊海慧，支金華，吳靜蕊

（西安醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，陜西西安 710309）

原發(fā)性肺癌是迄今為止惡性程度最高的腫瘤之一，其死亡率在世界上所有腫瘤中最高。在所有原發(fā)性肺癌中，主要類型是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌的85%以上。與小細(xì)胞肺癌相比，非小細(xì)胞肺癌對化療相對不敏感，然而由于惡性腫瘤基因突變的異質(zhì)性、多樣性以及極其復(fù)雜的分子機(jī)制，再加上各種外部因素的影響，如吸煙史、T分期、手術(shù)方法和淋巴結(jié)清掃等，患者的預(yù)后不容樂觀。因此本文就近幾年與NSCLC預(yù)后相關(guān)的miRNA及其SNP的作用機(jī)制和相關(guān)研究方法做了歸納總結(jié)，為NSCLC的深入研究提供了理論依據(jù)。

1 miRNA及其相關(guān)SNP的作用機(jī)制

1.1 miRNA的作用機(jī)制

MicroRNA（miRNA）是在植物、動(dòng)物和某些病毒中發(fā)現(xiàn)的非編碼單鏈小分子RNA，含有19～25個(gè)核苷酸，其作用是RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。在真核細(xì)胞中，miRNA首先轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞核中的pri-miRNA，并在初始剪接后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行最終修飾，成為19～25 nt的成熟miRNA，并且成熟的miRNA可作為基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。隨著生物技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步和實(shí)驗(yàn)方法的豐富，miRNA的作用也逐步被證實(shí)，它能夠通過其自身特異性結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別并連接靶mRNA上3'端和5'端非翻譯區(qū)序列上的特異性識(shí)別區(qū)域，反過來引起識(shí)別的mRNA的翻譯抑制或降解，從而阻斷靶基因的翻譯和蛋白質(zhì)的表達(dá)。人類約有1/3基因受到miRNA調(diào)控。

由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了miRNA的作用，許多學(xué)術(shù)期刊都發(fā)表了關(guān)于miRNA的文章，研究人員密切關(guān)注它的發(fā)現(xiàn)和功能。目前，徐艷敏[1]、赫羽喆[2]等人均表示miRNA的研究主要集中在miRNA的發(fā)現(xiàn)和靶標(biāo)的預(yù)測上，并且逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯镏扑幒图膊】刂品矫娴膽?yīng)用。由于miRNA與靶基因mRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常位于靶mRNA的3'末端非翻譯區(qū)，因此有關(guān)miRNA作用機(jī)制的研究主要集中在靶基因mRNA 3'末端非翻譯區(qū)的miRNA和mRNA之間的相互作用。但 近 些 年 Orom UA，Place R F，Tay Y 等 開 始 了mRNA的5'UTR[3]、啟動(dòng)子區(qū)[4]和編碼區(qū)[5]miRNA-mRNA相互作用的研究[6]。由于每個(gè)miRNA可識(shí)別多達(dá)20個(gè)靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，即使miRNA轉(zhuǎn)錄本僅有22個(gè)堿基，僅占所有轉(zhuǎn)錄基因的1%～5%，但可以調(diào)節(jié)多達(dá)30%的功能基因的表達(dá)。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)論說明miRNA可以調(diào)控很多的生物學(xué)功能，如細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、腫瘤的形成、病毒的復(fù)制和細(xì)胞的死亡等[7]。腫瘤形成的根本原因是DNA損傷。其中，miRNA的遺傳變異是導(dǎo)致DNA修復(fù)缺陷最重要的原因，因此miRNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

隨著近年來科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展及誘導(dǎo)凋亡中的作用機(jī)制研究已經(jīng)成為很多科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)[5]。miRNA有調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)特性，因此它既能作為腫瘤抑制基因，下調(diào)靶原癌基因的活性，它也可以作為腫瘤促進(jìn)基因，下調(diào)靶腫瘤抑制基因的活性[8]。許多研究發(fā)現(xiàn)，特定腫瘤特異性miRNA水平的分析有助于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估[9]，為探索腫瘤侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找早期診斷標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)研究提供了新的方向。

1.2 miRNA基因相關(guān)SNP的作用機(jī)制

隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)、高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及研究水平的深化，miRNA相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）逐漸成為與腫瘤等各種疾病密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。SNP可能在人類基因組每幾百個(gè)堿基中引起一個(gè)突變，并且當(dāng)miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNP起作用時(shí)，便會(huì)影響miRNA-mRNA結(jié)合，從而導(dǎo)致疾病。因此，miRNASNP為各種疾病，特別是腫瘤的臨床治療提供了新的策略。

2 MiRNA-SNP和NSCLC

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA及其相關(guān)的SNP有望成為NSCLC臨床治療和療效有效預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，同時(shí)確定并證實(shí)了在肺癌及其他腫瘤中許多與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、藥物療效、易感性評估、臨床結(jié)局預(yù)測等多個(gè)方面關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)[10]。miRNA基因的SNP主要位于初級miRNA轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA）、miRNA前體（premiRNA）的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域，甚至是成熟miRNA序列中。miRNA基因的SNP主要通過影響miRNA的加工和/或影響miRNA-mRNA的相互作用來干擾miRNA的調(diào)控作用，與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后預(yù)測密切相關(guān)。NSCLC相關(guān)miRNA基因及其相關(guān)SNP的研究有利于解釋肺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，明確肺癌的致病機(jī)制，對肺癌的診斷、治療和提高患者的生存率具有重要意義。

3 檢測NSCLC預(yù)后效果的常用研究方法

3.1 臨床資料

選擇患有非小細(xì)胞肺癌的病人和未患病的健康人群作為不同樣本。定義非小細(xì)胞肺癌患者人群的標(biāo)準(zhǔn):通過手術(shù)活檢診斷為NSCLC并且沒有肺癌家族史的患者。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)為:經(jīng)過CT、PET-CT等臨床檢查結(jié)果，肺部占位性病變外滲、無刺激性干咳、痰中不帶血或無血痰、無胸痛等相關(guān)癥狀，同一時(shí)期在醫(yī)院體檢的健康人群[11]。

3.2 NSCLC診斷與分期

通過開胸手術(shù)、纖維支氣管鏡檢查等方式獲取肺部組織，通過病理診斷證實(shí)，診斷為NSCLC。使用國際肺癌研究協(xié)會(huì)（IASLC）2009年第7版病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行NSCLC分期[12]。

3.3 樣品采集及處理

NSCLC組和對照組患者晚8點(diǎn)后禁食，空腹12 h以上，早晨肘部靜脈采血5 mL并提取DNA。

3.4 Taqman SNP基因分型

設(shè)計(jì)一對針對待檢測的靶SNP位點(diǎn)序列的PCR引物和Taqman探針。設(shè)計(jì)的兩個(gè)Taqman探針序列基本相同，除了SNP位點(diǎn)的堿基不同外，其他序列相同，5'末端用熒光基團(tuán)標(biāo)記，3'末端用淬滅基團(tuán)標(biāo)記。探針與模板DNA結(jié)合以覆蓋靶SNP位點(diǎn)，當(dāng)探針完整時(shí)，淬滅基團(tuán)可吸收熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光，在實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增期間，探針與模板退火，然后Taq DNA聚合酶切除探針5'端的熒光分子。游離的熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅集團(tuán)后，脫離其抑制并發(fā)出熒光信號(hào)（參見圖1）。通過實(shí)時(shí)PCR儀記錄熒光顏色的變化，以確定SNP位點(diǎn)的特定基因型是純合的野生型、雜合型還是純合的突變型[13]。

圖1 Taqman探針法原理

3.5 基因型鑒定

通過SDS軟件Allelic Discrimination程序分析基因型，并檢測由相同基因的不同等位基因標(biāo)記的熒光集團(tuán)和淬滅集團(tuán)的熒光強(qiáng)度，判斷待測樣本的基因型[14]。

3.6 樣本信息收集及臨床隨訪

收集患者基本資料，包括姓名、性別、年齡、地址、電話號(hào)碼、職業(yè)、婚姻狀況、教育程度等；個(gè)人情況，包括肺癌家族史、吸煙史、長期用藥史等。治療情況，包括住院時(shí)間、影像變現(xiàn)、手術(shù)信息、出院時(shí)療效、隨訪時(shí)間等。

患者出院3個(gè)月后接受第一次隨訪，專業(yè)人員電話咨詢患者出院后是否進(jìn)行過復(fù)查，包括:影像學(xué)檢查、血清學(xué)檢查等；是否有復(fù)發(fā)及再次手術(shù)治療情況；是否重新接受過藥物、放化療、放療；是否存在長期并發(fā)癥以及患者的生存和死亡狀況以及死亡時(shí)間。隨訪間隔時(shí)間為3個(gè)月，周期為3年。

3.7 臨床預(yù)后分析方法

采用卡方檢驗(yàn)和Fisher's檢驗(yàn)分析患者的年齡、性別、吸煙史、病理類型、術(shù)后化療、生存狀態(tài)和復(fù)發(fā)狀態(tài)等有無差異。然后使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析這些臨床指標(biāo)對總體存活率（OS）和無復(fù)發(fā)存活率（RFS）的影響。計(jì)算存活死亡及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)率（HRs）、95%置信區(qū)間和P值。在Cox回歸分析中，使用諸如年齡、性別、吸煙史、病理類型和術(shù)后化學(xué)療法等臨床指標(biāo)來相互校正。所有測試雙側(cè)P值小于0.05時(shí)才被判定為具有顯著性差異。使用Kaplan- Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)（對數(shù)秩檢驗(yàn)）來評估不同患者組之間的總體存活率和無復(fù)發(fā)存活率是否存在差異。

4 問題和展望

NSCLC具有惡性程度高、發(fā)病隱匿、早期不易發(fā)現(xiàn)，預(yù)后效果差、5年生存率低等特點(diǎn)。為找到有效的治療方案并改善預(yù)后狀況，腫瘤標(biāo)記物已被廣泛應(yīng)用于NSCLC的鑒定、治療效果的觀察和預(yù)后的監(jiān)測中，此外，對腫瘤標(biāo)記物的研究已從分子水平發(fā)展到基因水平。研究證實(shí)了NSCLC患者miRNA-SNP的異常表達(dá)，這與NSCLC患者的預(yù)后密切相關(guān)，已成為NSCLC預(yù)后的有效分子標(biāo)記物。它為改善患者術(shù)后病情和降低復(fù)發(fā)死亡率提供了新的研究方向。但目前的研究還不夠深入，如何將目前的研究結(jié)果與臨床診治、科學(xué)用藥結(jié)合起來，為患者制定更個(gè)性化的治療方案，如何分析預(yù)后價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。