重組人源化抗TNF-α單抗純度穩(wěn)定性的研究

曾晶，陳小敏

（1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南郴州 423000；2.深圳波頓香料有限公司，廣東深圳 518051）

單克隆抗體具有高特異性、高活性和低毒性等特點(diǎn)，從而使其在醫(yī)藥領(lǐng)域備受關(guān)注，并逐漸成為國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)企業(yè)的研究熱點(diǎn)[1-2]。但單抗類藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不穩(wěn)定，尤其是在藥物收獲期間容易降解和失活[3]，這些降解不僅會(huì)降低抗體純度，還可能引發(fā)患者的免疫反應(yīng)產(chǎn)生諸多安全問(wèn)題。因此，如何減少單抗在生產(chǎn)過(guò)程中的降解以保證其純度的穩(wěn)定是生物藥最終成功應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵[4-6]。

生物仿制藥的研發(fā)過(guò)程具有所有生物藥物的技術(shù)復(fù)雜性，因此工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響極大。若生物仿制藥產(chǎn)品質(zhì)量與原研藥不一致[7]，或者在整個(gè)產(chǎn)品生產(chǎn)周期內(nèi)出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題，對(duì)生物仿制藥的研發(fā)將是毀滅性的打擊[8]。

在抗體收獲期間，最容易遇到的是純度降解問(wèn)題，主要原因是收獲過(guò)程中離心等操作的機(jī)械剪切力會(huì)對(duì)抗體造成一定的損傷[9]，另一方面，細(xì)胞在大剪切力下會(huì)發(fā)生裂解從而釋放出大量的還原性酶使抗體的二硫鍵斷裂[10]，這不僅會(huì)影響抗體純度，而且對(duì)抗體臨床用藥的安全性和有效性也會(huì)產(chǎn)生極大的影響。

有研究顯示，在抗體收獲期間，向培養(yǎng)液中不間斷通氣能保護(hù)抗體的二硫鍵[11]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)通氣對(duì)抗體純度具有一定的保護(hù)作用，但持續(xù)通入空氣會(huì)導(dǎo)致抗體主峰減少和酸性峰增加。CuSO4作為一種氧化劑，它能使抗體中自由巰基量減少，也可以促使未成對(duì)的二硫鍵進(jìn)一步結(jié)合[12]。EDTA-2Na作為一種金屬螯合劑，能夠有效地與金屬離子結(jié)合，由于多數(shù)核酸酶和部分蛋白酶的催化作用需要Mg2+存在，故常用作核酸酶、蛋白酶的抑制劑，從而抑制還原酶的還原作用。

單抗純度穩(wěn)定性是單抗生產(chǎn)中的一個(gè)重要指標(biāo)，也是各制藥商重點(diǎn)研究的內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加酶抑制劑或者抗還原劑的方式，使抗體在下罐過(guò)程中的純度更加穩(wěn)定，對(duì)單抗藥物的生產(chǎn)具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)品為重組人源化抗TNF-α單抗，由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞發(fā)酵液由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制得；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、CuSO4均購(gòu)于Sigma公司；高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)為Beckman公司的PA800 Plus。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液裂解

取400 mL發(fā)酵液置于-80 ℃冰箱中，待全部?jī)鼋Y(jié)以后，拿出至室溫緩慢解凍，如此反復(fù)3～5次，采用反復(fù)凍融的方式進(jìn)行細(xì)胞裂解。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品放置條件

待細(xì)胞裂解后，8 000 r/min 條件下離心 10 min，收集上清，并用0.2 μm的濾膜過(guò)濾除菌。另配制CuSO4、EDTA-2Na母液并過(guò)濾除菌。在超凈臺(tái)中將細(xì)胞裂解液的上清分裝至5個(gè)無(wú)菌瓶中，每瓶100 mL。一瓶作為對(duì)照，不添加任何物質(zhì)；一瓶持續(xù)從底部通入流量為5 mL/min的無(wú)菌空氣；另兩瓶分別加入適量的EDTA-2Na、CuSO4母液，使其終濃度分別為 10 mmol/L EDTA-2Na 和 70 μmol/L CuSO4；另 取100 mL未裂解細(xì)胞的發(fā)酵液作為陰性對(duì)照。所有樣品均置于25 ℃條件下，分別于放置24 h和48 h時(shí)取樣進(jìn)行Protein-A純化，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Protein-A精細(xì)純化

Protein-A柱用pH為7.3的20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl平衡柱子，平衡體積為 15～ 20 mL；將上一步放置的實(shí)驗(yàn)樣品上柱，體積為15～20 mL；用沖洗緩沖液 20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl上柱，直至基線平穩(wěn)即可；再用pH 3.7的檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，觀察A280值并進(jìn)行純化后樣品的收集，待A280小于70時(shí)停止收集；最后用0.1 mol/L NaOH進(jìn)行清洗。

1.2.4 非還原十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管電泳（CE-SDS）

用超純水將上述樣品稀釋至2 mg/mL，將25 μL樣品、50μL 2×SDS 樣品緩沖液、5μL 250 mmol/L碘乙酰胺加入離心管，最后加入超純水補(bǔ)至終體積為100 μL，渦旋混勻 20 s，70 ℃條件下水浴 4 min，取75 μL至上樣瓶進(jìn)行上機(jī)分析。分離電壓為15 kV，毛細(xì)管溫度為（20±2）℃，樣品傳送帶溫度為（17±2）℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂解細(xì)胞

反復(fù)凍融多次后對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行前后對(duì)比，結(jié)果如表2。

表2 凍融前后細(xì)胞密度活力

從表2可以看出，反復(fù)凍融后60%的細(xì)胞發(fā)生了裂解，該條件可模擬大部分細(xì)胞發(fā)生裂解使得內(nèi)含物被釋放，進(jìn)而提供單抗被還原的環(huán)境。

2.2 非還原CE-SDS

對(duì)非還原CE-SDS方法進(jìn)行驗(yàn)證，同一標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)三次的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品非還原CE-SDS檢測(cè)純度

IgG標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%，且檢測(cè)結(jié)果均＞95%，表明該方法穩(wěn)定，能作為該單抗純度的檢測(cè)方法。

對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行檢測(cè)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 實(shí)驗(yàn)組非還原CE-SDS檢測(cè)純度

由未裂解組與對(duì)照組比較可知，細(xì)胞裂解后的內(nèi)涵物被釋放出來(lái)會(huì)導(dǎo)致單抗的純度由96.34%以上降低至59.78%，說(shuō)明純度降解模型構(gòu)建是成功的。另外三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示該條件能夠在一定程度上抑制單抗純度的降低，但只有EDTA-2Na能夠完全抑制還原酶，使單抗純度能夠持續(xù)維持在正常水平，發(fā)揮了提高抗體穩(wěn)定性的作用。

3 結(jié)論

本研究對(duì)單抗純度問(wèn)題進(jìn)行了探討，細(xì)胞裂解后釋放的還原酶能破壞抗體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致抗體純度降低，而通過(guò)添加CuSO4和EDTA-2NA能有效降低還原酶對(duì)抗體純度的影響。

在發(fā)酵下罐的過(guò)程中，還有一系列的操作能防止抗體被破壞。例如，采用臺(tái)式離心的方式進(jìn)行料液澄清以減少剪切力；添加還原酶抑制劑以抑制還原酶的作用；降低下罐料液的pH以降低相關(guān)酶的活性。在采用這些方式的同時(shí)，還需考慮此操作對(duì)電荷異質(zhì)性、多聚體以及多糖的影響，以保證抗體的安全性和有效性。