紫外指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)洞庭碧螺春的鑒別分析

張 麗，張文韜，劉文靜，劉騰飛，董明輝，郁志芳*

(1.蘇州市職業(yè)大學(xué) 教育與人文學(xué)院，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州市吳中區(qū)果蔬園藝站，江蘇 蘇州 215107；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；4.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全研究室，江蘇 蘇州 215155)

碧螺春茶作為我國十大名茶之一，自古以來就受到了人們的廣泛關(guān)注和喜愛。碧螺春茶所含的茶多酚、兒茶素、氨基酸等含量較高，而且味道鮮濃、口感醇厚[1-2]。但是，隨著碧螺春產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展與擴(kuò)大，當(dāng)前洞庭碧螺春茶出現(xiàn)了產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊、假冒偽劣產(chǎn)品泛濫等諸多問題，嚴(yán)重影響了碧螺春茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。因此，有必要對(duì)碧螺春茶進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和真?zhèn)舞b別，進(jìn)而保護(hù)名優(yōu)茶的獨(dú)特品質(zhì)[4-5]。

化學(xué)指紋圖譜是以化學(xué)成分為基礎(chǔ)進(jìn)行的光譜或者色譜研究，通過測(cè)定樣品中的多種特征化學(xué)成分并以此鑒定和獲得化學(xué)成分穩(wěn)定性的特性圖譜，通過樣品的整體化學(xué)信息特征來控制其質(zhì)量，是一種綜合、可量化的、可對(duì)成分復(fù)雜物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制的方法[6-7]。目前應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)對(duì)中藥質(zhì)量和產(chǎn)地鑒別的研究已經(jīng)非常廣泛[8]。然而，在洞庭碧螺春茶的質(zhì)量等級(jí)和產(chǎn)地鑒別中應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)的報(bào)道較少，陳波等[9]選擇 9 000～4 000 cm-1的近紅外光譜對(duì)不同等級(jí)的碧螺春茶葉進(jìn)行掃描，結(jié)果表明不同等級(jí)的碧螺春可以通過近紅外光譜分析進(jìn)行分類。劉臣等[10]以咖啡堿為參照物建立了蘇州洞庭碧螺春茶的高效液相指紋圖譜，但是上述兩種儀器設(shè)備使用成本較高，不適宜實(shí)際生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，相對(duì)而言，紫外指紋圖譜能解釋樣品的整體信息，且成本較低，效率較高。

本研究主要以蘇州洞庭東山和西山的碧螺春茶為原料，通過紫外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)構(gòu)建洞庭碧螺春茶的紫外指紋圖譜，并利用主成分分析和偏最小二乘判別分析對(duì)洞庭東、西山的碧螺春茶進(jìn)行鑒別研究，以期為洞庭碧螺春茶的鑒別分析和等級(jí)評(píng)定提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1) 采用各等級(jí)碧螺春春茶作為試驗(yàn)樣品。樣品均來自蘇州市吳中區(qū)洞庭東山的6個(gè)廠家以及洞庭西山的4個(gè)廠家，且包含特級(jí)一等、特級(jí)二等、一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)等5個(gè)等級(jí)，按照洞庭碧螺春茶感官指標(biāo)的國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)廠家的各等級(jí)茶樣進(jìn)行嚴(yán)格挑選，所有茶樣均采用自封袋進(jìn)行獨(dú)立密封包裝，并將其存放于-20 ℃冰箱中。將洞庭東山6個(gè)廠家的樣品依次標(biāo)記為A、B、C、D、E、F，洞庭西山4個(gè)廠家的樣品依次標(biāo)記為G、H、I、J，此外，碧螺春茶的5個(gè)等級(jí)依次標(biāo)記為T1、T2、1、2、3。

2) 試驗(yàn)試劑主要為甲醇、丙酮、氯仿和無水乙醇等試劑，均為分析純。

3) 試驗(yàn)主要設(shè)備為電子天平(SQP，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(FW100，天津市泰斯特儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-300DB，昆山市超聲儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1800，日本島津公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1) 樣品處理：將購買的碧螺春茶樣品用高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩，放于自封袋中備用。準(zhǔn)確稱取樣品0.300 0 g，置于25 mL具塞刻度試管中，加入95%甲醇20 mL，將試管進(jìn)行密塞，超聲提取40 min后過濾得到其濾液，取1 mL濾液置于100 mL容量瓶中并用95%甲醇定容，搖勻待測(cè)。

2) 測(cè)試條件：將待測(cè)的提取液用UV-1800紫外可見分光光度計(jì)以相應(yīng)溶劑調(diào)整基線，并作為參比溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，設(shè)定掃描波長(zhǎng)范圍為190～400 nm，狹縫為1 nm，采樣間隔為0.2 nm，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

3) 提取溶劑優(yōu)化：以AT2樣品為考察對(duì)象，準(zhǔn)確稱取0.300 0 g樣品3份，置于25 mL具塞刻度試管中，分別加入超純水、95%甲醇、95%乙醇、95%丙酮、氯仿各20 mL，超聲提取50 min后過濾得到其濾液，并將各濾液分別稀釋10、25、50、100倍之后進(jìn)行紫外光譜掃描測(cè)定。

4) 超聲時(shí)間優(yōu)化。以AT2樣品為考察對(duì)象，準(zhǔn)確稱取0.300 0 g樣品3份，置于25 mL具塞刻度試管中，加入95%甲醇20 mL后密塞，分別超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min后過濾得到其濾液，取1 mL濾液置于100 mL容量瓶中并用95%甲醇定容，搖勻后進(jìn)行紫外光譜掃描測(cè)定。

5) 精密度試驗(yàn)：以AT2樣品為考察對(duì)象，采用上述樣品處理方法和測(cè)試條件進(jìn)行紫外光譜掃描，重復(fù)測(cè)定7次，計(jì)算吸收波長(zhǎng)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察精密度[13]。

6) 重復(fù)性試驗(yàn)：以AT2樣品為考察對(duì)象，采用上述樣品處理方法處理樣品，分別稱取7份，以上述測(cè)試條件進(jìn)行紫外光譜掃描，計(jì)算吸收波長(zhǎng)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察重復(fù)性[13]。

7) 穩(wěn)定性試驗(yàn)：以AT2樣品為考察對(duì)象，經(jīng)本研究的試驗(yàn)方法處理的樣品，分別在0、2、4、6、8、10、24 h處理，以本研究的測(cè)試條件進(jìn)行紫外光譜掃描，計(jì)算吸收波長(zhǎng)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取溶劑

洞庭碧螺春茶樣品分別用超純水、95%甲醇、95%乙醇、95%丙酮、氯仿等溶劑進(jìn)行提取后，由紫外光譜圖可知，以95%甲醇為提取劑的色譜吸收峰數(shù)目最多，表明洞庭碧螺春茶化學(xué)成分被提取的最充分。而且當(dāng)濾液稀釋100倍時(shí)特征峰明顯，有利于對(duì)不同碧螺春茶樣品進(jìn)行區(qū)分，因此，選擇95%甲醇作為最佳提取溶劑，并將濾液稀釋100倍后進(jìn)行紫外光譜掃描。

2.2 最佳提取時(shí)間

碧螺春茶樣品超聲提取時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min后，超聲結(jié)果表明，當(dāng)以95%甲醇為提取劑的超聲時(shí)間為20 min時(shí)，吸收峰數(shù)目最少；30 min次之；當(dāng)超聲40 min和50 min時(shí)，吸收峰數(shù)目變化不大。因此，選擇最佳提取時(shí)間為40 min。

2.3 方法學(xué)考察

50個(gè)洞庭碧螺春茶樣品分別用超純水、95%甲醇、95%乙醇、95%丙酮、氯仿等溶劑進(jìn)行提取后，以95%甲醇為提取溶劑所得到的紫外光譜的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD均為1%以下，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.4 碧螺春茶紫外指紋圖譜分析

紫外指紋圖譜是由于不同物質(zhì)體系化學(xué)成分含量和不飽和程度的差異，導(dǎo)致峰形、峰高、峰面積等具有差異，因而可通過對(duì)不同物質(zhì)體系的紫外指紋圖譜進(jìn)行鑒別分析。50個(gè)碧螺春茶的紫外指紋圖譜疊加后如圖1所示。由圖1可知，不同產(chǎn)地、不同等級(jí)碧螺春茶之間原始圖譜的出峰位置和峰形相似，但吸光度大小均具有差異。結(jié)果表明，各碧螺春茶樣品之間的主要化學(xué)成分組成相似，但含量存在差異，具有指紋特性。

圖1 洞庭碧螺春茶紫外指紋圖譜

圖2 洞庭東山碧螺春茶紫外指紋圖譜

圖3 洞庭西山碧螺春茶紫外指紋圖譜

來自洞庭東山和西山的碧螺春茶紫外指紋圖譜疊加如圖2和圖3所示。由此可知，相同產(chǎn)地不同廠家不同等級(jí)碧螺春茶之間的共有峰在紫外光譜圖的特征區(qū)(200～300 nm)中峰形相似，峰高存在差異。對(duì)比圖2和圖3可知，洞庭東山和西山碧螺春茶的紫外指紋圖譜主要共有峰的吸收波長(zhǎng)分布在203 nm、210 nm、265 nm、270 nm附近。紫外指紋圖譜之間峰高存在差異，洞庭東山產(chǎn)區(qū)第一個(gè)波峰的最大吸收值為2.513，最小吸收值為0.896；第二個(gè)波峰的最大吸收值為0.680，最小吸收值為0.143。洞庭西山產(chǎn)區(qū)第一個(gè)波峰的最大吸收值為2.027，最小吸收值為0.767；第二個(gè)波峰的最大吸收值為0.418，最小吸收值為0.119。

結(jié)果表明：不同產(chǎn)區(qū)，不同等級(jí)碧螺春茶之間的主要化學(xué)組成成分相似，但主要成分含量之間存在差異，洞庭西山的化學(xué)成分含量低于東山碧螺春茶，碧螺春茶的主要化學(xué)成分含量存在個(gè)體差異和產(chǎn)地之間的差異。

3 數(shù)據(jù)處理

將所測(cè)50個(gè)碧螺春茶樣品的原始紫外指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)V-Probe 2.43中進(jìn)行一階求導(dǎo)的處理，然后分別將原始數(shù)據(jù)和一階求導(dǎo)后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行單位方差換算(unit variance scaling)后，再進(jìn)行主成分分析以及偏最小二乘判別分析。

3.1 主成分分析

主成分分析法(PCA)是一種將原來反映樣品信息的多個(gè)變量進(jìn)行整合，壓縮成少數(shù)幾個(gè)綜合變量，可以用二維圖直觀反映樣品信息的統(tǒng)計(jì)分析方法[11，14]。同時(shí)，它也是一種非監(jiān)督模式識(shí)別方法[15]。將碧螺春茶樣品的原始紫外光譜數(shù)據(jù)和一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件中，經(jīng)過單位方差換算處理后，進(jìn)行主成分分析，用以區(qū)分碧螺春茶的不同產(chǎn)地和不同等級(jí)。

3.1.1 原始數(shù)據(jù)PCA

碧螺春茶的原始紫外指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析后的二維得分分布如圖4所示。由圖4可知，第一主成分和第二主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.9%，各碧螺春茶樣品之間的關(guān)系可以在PCA得分圖中直觀地顯示出來。

1) 從洞庭東山和西山的碧螺春茶在PCA得分圖中可以看出，產(chǎn)地為洞庭西山的 G、H、J等3個(gè)廠家的碧螺春茶與洞庭東山的A、B、C、D、E、F等6個(gè)廠家的大部分樣品之間距離較遠(yuǎn)。由此可以表明，不同產(chǎn)地碧螺春茶之間的地域差異明顯，紫外指紋圖譜對(duì)于不同產(chǎn)地之間的碧螺春茶可以較好地進(jìn)行區(qū)分。

圖4 洞庭碧螺春茶原始數(shù)據(jù)PCA主成分分析

2) 從不同廠家的碧螺春茶在得分圖中可以看出，G廠家中除G2外，其他4個(gè)等級(jí)碧螺春茶聚到一起，H廠家的5個(gè)等級(jí)茶樣聚到一起，表明G廠家和H廠家不同等級(jí)碧螺春茶之間具有很大的相似性，沒有進(jìn)行很好的區(qū)分，因而聚到一起。并且除AT1、CT1、DT1、ET1外，AT2、BT1、BT2、CT2、DT2、ET2、FT1、FT2等6個(gè)廠家中的特級(jí)碧螺春茶距離較近，且分別與各自廠家的非特級(jí)碧螺春茶之間距離較遠(yuǎn)，表明洞庭東山的碧螺春特級(jí)茶和非特級(jí)茶之間差異明顯，可以較好地對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。

圖5 洞庭碧螺春茶一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)PCA主成分分析

3.1.2 一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)PCA

碧螺春茶的一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析后的二維得分分布如圖5所示。由圖5可知，第一主成分和第二主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為70.5%，各碧螺春茶樣品之間的關(guān)系可以在PCA得分圖中直觀地顯示出來。

1) 洞庭東山和西山的碧螺春茶在PCA得分圖中，產(chǎn)地為洞庭西山的G、H、J等3個(gè)廠家的碧螺春茶與洞庭東山的A、B、C、D等4個(gè)廠家的大部分樣品之間距離較遠(yuǎn)。一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)的結(jié)果雖與原始數(shù)據(jù)結(jié)果不完全等同，但也可以表明，不同產(chǎn)地碧螺春茶之間的地域差異明顯，紫外指紋圖譜對(duì)于不同產(chǎn)地之間的碧螺春茶可以進(jìn)行良好的區(qū)分。

2) 不同廠家的碧螺春茶在得分圖中，A、G、H廠家的5個(gè)等級(jí)茶樣分別聚到一起，且G、H廠家又明顯混合聚在一起，表明G和H廠家不同等級(jí)碧螺春茶之間具有很大的相似性，沒有進(jìn)行很好的區(qū)分，因而聚到一起。而BT2、CT2、DT2、FT1等4個(gè)廠家中的碧螺春特級(jí)茶距離較近，與各自廠家的碧螺春非特級(jí)茶之間并沒有很好的分開，表明一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)的處理結(jié)果不如原始數(shù)據(jù)結(jié)果明顯，這可能與前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率有關(guān)。因而，一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)對(duì)于等級(jí)區(qū)分效果不明顯。

3.2 偏最小二乘判別分析

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是一種監(jiān)督模式識(shí)別方法，根據(jù)吸收值差異建立區(qū)別樣品模型[12]。它可以分別提取自變量和因變量中能最大代表其特性的潛在變量，并對(duì)潛在變量進(jìn)行線性或非線性回歸建模，最終來預(yù)測(cè)方法的可行性[16-17]。將50個(gè)碧螺春茶樣品的紫外指紋圖譜的吸收波長(zhǎng)和相應(yīng)的吸光值導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件中，選擇PLS-DA進(jìn)行分析。

3.2.1 原始數(shù)據(jù)PLS-DA

對(duì)原始數(shù)據(jù)采用SIMCA-P 14.0軟件自動(dòng)優(yōu)化，選擇2個(gè)潛在主成分構(gòu)建模型。結(jié)果顯示，訓(xùn)練集2個(gè)潛在主成分的累計(jì)解釋力R2為0.958。不同產(chǎn)地碧螺春茶原始數(shù)據(jù)的PLS-DA得分如圖6所示。由圖6可知，依據(jù)復(fù)雜的紫外光譜信息，得分圖客觀地顯示了碧螺春茶的紫外光譜與不同產(chǎn)地、廠家和等級(jí)之間的關(guān)系；PLS-DA分析結(jié)果與相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)主成分分析結(jié)果相似，對(duì)于不同產(chǎn)地的碧螺春茶之間的區(qū)分效果明顯，而對(duì)于不同等級(jí)碧螺春茶的鑒別提供了特級(jí)茶和非特級(jí)茶的區(qū)分效果，而對(duì)于其他等級(jí)的區(qū)分效果并不明顯。

圖6 洞庭碧螺春茶原始數(shù)據(jù)PLS-DA

3.2.2 一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)PLS-DA

對(duì)一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)采用SIMCA-P 14.0軟件自動(dòng)優(yōu)化，選擇2個(gè)潛在主成分構(gòu)建模型。結(jié)果顯示，訓(xùn)練集2個(gè)潛在主成分的累計(jì)解釋力R2為0.702。不同產(chǎn)地碧螺春茶一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)的PLS-DA得分如圖7所示。由圖7可知，依據(jù)復(fù)雜的紫外光譜信息，得分圖客觀地顯示了碧螺春茶的紫外光譜與不同產(chǎn)地、廠家和等級(jí)之間的關(guān)系；PLS-DA分析與一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果相似，對(duì)于不同產(chǎn)地碧螺春茶之間的區(qū)分效果明顯，與原始數(shù)據(jù)處理結(jié)果可保持良好的一致性，而對(duì)于不同等級(jí)碧螺春茶的區(qū)分效果并不明顯。

圖7 碧螺春茶一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)PLS-DA

4 結(jié)論與討論

1) 紫外光譜法具有操作方便、高效率、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用到食品、制藥、化工等領(lǐng)域[18-20]。本試驗(yàn)通過對(duì)50個(gè)碧螺春茶樣品進(jìn)行紫外光譜掃描，將所得紫外指紋圖譜原始數(shù)據(jù)和一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件中進(jìn)行主成分分析，據(jù)此反映樣品之間的相關(guān)性，同時(shí)利用具有監(jiān)督模式的偏最小二乘判別分析對(duì)潛在變量進(jìn)行模型的建立，最終預(yù)測(cè)方法的可行性[21]。

2) 通過試驗(yàn)確定了碧螺春茶的最佳提取溶劑為95%甲醇，最佳提取時(shí)間為40 min。碧螺春茶紫外光譜曲線重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高。不同產(chǎn)地和不同等級(jí)碧螺春茶的紫外指紋圖譜峰形比較相似，但吸光度不同，表明不同產(chǎn)地和不同等級(jí)之間的樣品化學(xué)成分含量有一定的差異。

3) 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SIMCA-P 14.0軟件進(jìn)行主成分分析，由原始數(shù)據(jù)和一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)的PCA得分圖可知，洞庭東山和西山的碧螺春茶產(chǎn)地之間的距離較遠(yuǎn)，表明不同產(chǎn)地碧螺春茶之間的主要化學(xué)成分含量有差異，紫外光譜法對(duì)于不同產(chǎn)地碧螺春茶之間的區(qū)分效果較好。此外，對(duì)于不同等級(jí)碧螺春茶之間的鑒別效果，一階求導(dǎo)數(shù)據(jù)所得結(jié)果不能很好地將等級(jí)進(jìn)行區(qū)分。而原始數(shù)據(jù)所得結(jié)果可以初步地將碧螺春特級(jí)茶和非特級(jí)茶進(jìn)行區(qū)分，但是對(duì)于特級(jí)一等、特級(jí)二等、一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)碧螺春茶之間的區(qū)分效果并不明顯。其原因可能是與碧螺春茶之間的主要化學(xué)成分含量本身就只有細(xì)微差異，而且由張穎彬等[22]的研究結(jié)果可知，碧螺春特級(jí)一等與特級(jí)二等，一級(jí)與二級(jí)分差較小，其余等級(jí)間分差較大。因此，等級(jí)之間較小分差可能導(dǎo)致不同等級(jí)的確切區(qū)分效果并不理想。此外，采用具有監(jiān)督模式的PLSDA進(jìn)行分析，所得結(jié)果與PCA分析結(jié)果較一致。

以上結(jié)果表明，采用紫外指紋圖譜對(duì)于鑒別不同產(chǎn)地碧螺春茶具有較好的效果，但對(duì)于不同等級(jí)之間的區(qū)分效果并不明顯。根據(jù)肖益等[23]的研究可知，不同品種茶葉在382 nm波長(zhǎng)處的紫外吸收值具有比較明顯的差異，采用紫外光譜技術(shù)可以快速對(duì)不同品種茶葉進(jìn)行分類鑒別。而本試驗(yàn)中除了產(chǎn)地之間的不同之外，還有碧螺春茶的5個(gè)等級(jí)之間的區(qū)分。因此，在以后針對(duì)不同等級(jí)碧螺春茶之間的鑒別試驗(yàn)中，可通過增加產(chǎn)地個(gè)數(shù)和不同品種來進(jìn)一步修正模型，以提高準(zhǔn)確率。