平菇原生質(zhì)體單核化菌株的制備及其培養(yǎng)特征分析

努爾孜亞·亞力買買提，趙夢然，羅 影，郝敬喆，魏 鵬，賈文捷，賈培松，溫切木·阿布列孜

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，北京 100081 ；3. 阿勒泰市菜籃子工程辦公室,新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【本研究意義】平菇(oyster mushroom)隸屬于真菌界、擔(dān)子菌門 、蘑菇綱、蘑菇目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬(Pleurotus)，其肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有很高食用和保健價值[1]。平菇栽培具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，2002 年我國平菇年總產(chǎn)量 100 ×104t以上，社會產(chǎn)值超過 30 ×108元。2006 年全國平菇總產(chǎn)量達(dá) 397 ×104t，平菇具有較強(qiáng)的木質(zhì)素和纖維素分解能力，年產(chǎn)量長年在500×104t左右。目前平菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨著品種由于長期無性繁殖而菌種退化明顯、產(chǎn)量不穩(wěn)、育種手段單一等實際問題，亟待選育新的平菇優(yōu)良品種，加速品種更新?lián)Q代[2-3]。【前人研究進(jìn)展】原生質(zhì)體技術(shù)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的一個重要分支[4-5]，研究擔(dān)子菌的原生質(zhì)體制備技術(shù)，將此技術(shù)應(yīng)用于平菇、香菇、金針菇等多種食用菌中發(fā)現(xiàn)，單核原生質(zhì)體是異宗結(jié)合食用菌菌絲制備原生質(zhì)過程中的一個普遍現(xiàn)象[6]。選用食用菌野生資源或具有優(yōu)良性狀的栽培種質(zhì)資源，利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)制備單核體，使用再生獲得的單核菌株進(jìn)行雜交育種已經(jīng)成為多種食用菌新品種選育普遍采用的一種手段[7-8]?！颈狙芯壳腥朦c】原生質(zhì)單核化現(xiàn)象是原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌遺傳和育種研究中的一個重要分支，由于單核原生質(zhì)體具有特殊的遺傳背景，在理論上是研究其基因定位和遺傳性狀的重要材料，在育種上形成以單核原生質(zhì)體為材料的新方向,具有廣闊的應(yīng)用和推廣前景，從細(xì)胞水平上探索一條食用菌育種新途徑,為發(fā)展和完善食用菌新菌株選育提供依據(jù)[9-11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用原生質(zhì)體單核化技術(shù)進(jìn)行平菇新菌株的選育,對平菇原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行優(yōu)化，將得到的原生質(zhì)體單核菌株與出發(fā)菌株在菌落形態(tài)、菌絲長速和長勢等方面的差異進(jìn)行比較，評價供試菌株的多樣性水平，為平菇新品種選育提供創(chuàng)制材料及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株

平菇菌株4453、4062、4072、457、504、1105、1118、3780、3778、4010、4100、1709、4117、4131、4159、4181、4440、4146、338均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所提供，所有菌株均保藏于國家食用菌標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(CCMSSC)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

(1) PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，補(bǔ)水至 1 L，pH自然(約為7.0)；121℃，高壓蒸汽滅菌30 min。

(2)PDA 液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 15 g，補(bǔ)水至 1 L，pH自然(約為7.0)；121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

(3)MYG 再生培養(yǎng)基：麥芽糖 10 g，葡萄糖 4 g，酵母膏 4 g，0.6 M甘露醇，瓊脂粉 20 g，補(bǔ)水至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，用于原生質(zhì)體菌絲培養(yǎng)。

1.1.3 供試試劑

(1)0.6 M甘露醇：稱取Journal of fungus甘露醇，補(bǔ)水至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

(2)2%溶壁酶：20 mL的0.6 M甘露醇溶液加入0.4 g溶壁酶，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)

將保存菌株接種至PDA 綜合培養(yǎng)基平板活化，純化后，取豆粒大小菌塊接種至PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗靜置培養(yǎng)5 d備用。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備

將菌絲體接入PDA 液體培養(yǎng)基,25℃靜止培養(yǎng) 5～6 d，待長出菌絲球后在無菌操作條件下，將液體培養(yǎng)基與菌絲經(jīng)篩子過濾，去除培養(yǎng)基。篩子中菌絲體用無菌水沖洗，再用0.6 M甘露醇沖洗離心(2 000 r/min,5 min)2次。然后用濾紙吸干水分，將菌絲體轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中，加入3 mL 2%的溶壁酶，30℃水浴鍋中酶解，每隔30 min搖動1次，加快酶解速度。酶解結(jié)束后，將菌絲體/溶壁酶混合液倒入加有棉塞的滅菌注射器，過濾除去斷裂菌線，將濾液于3 000 r/min離心10 min，用移液槍吸掉上部液體(不要吸光，留少許)，收集沉淀，用0.6 M甘露醇稀釋。

1.2.3 原生質(zhì)體制備最適酶解時間檢測

選取13個菌株進(jìn)行最適酶解時間檢測，原生質(zhì)體制備過程中，設(shè)定取樣鏡檢時間：1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 h，鏡檢測得各時間節(jié)點原生質(zhì)體數(shù)量，根據(jù)各菌株原生質(zhì)體釋放量曲線，分析確定最適酶解時間，每個菌株設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 原生質(zhì)體再生

吸取 100 μL原生質(zhì)體稀釋液均勻涂布于再生培養(yǎng)基平板上，于25℃黑暗培養(yǎng)，從而獲得原生質(zhì)體再生菌株。

1.2.5 原生質(zhì)體再生菌株鏡檢

在顯微鏡下,從再生培養(yǎng)基上生長的菌落中挑選菌落小、生長緩慢的單個菌落，接種至PDA斜面培養(yǎng)基，待菌絲長到 1 cm 左右時進(jìn)行鏡檢，根據(jù)菌絲形態(tài)、有無鎖狀聯(lián)合等特征，判斷和挑選目標(biāo)菌株。

1.2.6 菌絲培養(yǎng)特征

將出發(fā)菌株和篩選的原生質(zhì)體單核菌株分別接種至PDA培養(yǎng)基平板活化，待菌落長至5～7 cm大小時，使用打孔器沿菌落邊緣取相同菌齡直徑為5 mm的菌餅接種至PDA平板中央，于25℃暗培養(yǎng)。每天觀察菌絲生長情況，定期統(tǒng)計菌絲培養(yǎng)特征，包括：菌絲長速、菌絲濃密度、氣生菌絲濃度和菌絲長勢等指標(biāo)。采用“十字”交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長速度，每種菌株設(shè)3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2010，SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、單因素方差分析(AVNOA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備最適酶解時間

研究表明，各菌株原生質(zhì)體釋放量隨酶解時間延長呈先升高再降低的趨勢，11個菌株在酶解處理3.5 h時原生質(zhì)體釋放量最大，占總數(shù)的的84.6%，2個菌株(4 131,4 146)在4 h時達(dá)最大；各菌株原生質(zhì)體釋放量存在一定差異，處理3.5 h時，菌株4 146原生質(zhì)體釋放量最大，可達(dá)2.12×107個/ml，其次為菌株4 131和1 118，其他菌株差異不明顯。酶解處理3.5 h是原生質(zhì)體取樣的最佳時間。圖1～2

圖 1 原生質(zhì)體產(chǎn)量隨酶解時間變化
Fig. 1 The curve of protoplast yield with different enzymolysis time

圖 2 平菇釋放出原生質(zhì)體(10×400)
Fig. 2 The protoplasts released by Ganoderma Lucidum(10×400)

2.2 原生質(zhì)體再生菌株統(tǒng)計分析

研究表明，共提取菌落2 026個，萌發(fā)1 427個，占總數(shù)的70.43%，獲得單核菌株81個，占萌發(fā)總數(shù)的5.67%；各菌株原生質(zhì)體萌發(fā)率和單核率均具有較大差異，原生質(zhì)體萌發(fā)率在 56.00 ～76.40 ，平均萌發(fā)率為69.62%，表明原生質(zhì)體萌發(fā)率較高；原生質(zhì)體單核率在1.16 ～ 16.00 ，單核率為5.74%，其中菌株4 062的獲得單核數(shù)量最多，占再生菌株的16%；菌株4 181、4 159、4 072、1 105單核數(shù)量最少，都僅獲得1個單核。供試菌株原生質(zhì)體單核率較低。表1，圖3～4

圖3 有鎖狀聯(lián)合的雙核菌絲
Fig. 3 Dikaryocyte with clamp connection

表1 單核菌株的數(shù)量以及單核獲得比例
Table 1 The quantity of monocytic strains and the rate of monokaryogenesis

序號Num.菌種Strain挑取數(shù)量Picking number萌發(fā)數(shù)量Germination number萌發(fā)率Germination rate (%)單核數(shù)量Mononuclear number單核獲得率Mononuclear Acquisition rate (%)1338896876.4034.4124571108072.7333.7535041299674.4244.1741 105996969.7011.4551 118967275.0056.94461 7091348059.70810.0073 7801168169.8344.9483 7781257056.0068.5794 0101188471.1933.57104 0621237560.981216.00114 0721238669.9211.16124 1001077469.1656.76134 117946670.2123.03144 131966567.71710.77154 146836072.2946.67164 1591087771.3011.29174 181976567.0111.54184 4401047875.00810.26194 4531098174.3133.70總計 Total2 0261 4271 322.8681108.98平均 Average108.4275.1169.624.265.74

圖4 無鎖狀聯(lián)合的單核菌絲
Fig.4 Monokaryotic mycelia that have no clamp connection

2.3 出發(fā)菌株與單核菌株菌落培養(yǎng)特征比較

研究表明，單核菌株與出發(fā)菌株在菌絲長速方面均具有顯著差異，但不具有一定的規(guī)律性，有12個單核菌株的菌絲長速顯著高于其出發(fā)菌株，占單核菌株的29.27%，有9個單核菌株的菌絲長速與其出發(fā)菌株相當(dāng)，占單核菌株的21.95%，有20個單核菌株的菌絲長速顯著低于其出發(fā)菌株，占單核菌株的48.78%；單核菌株與出發(fā)菌株在菌絲形態(tài)方面均具有顯著差異，但不具有一定的規(guī)律性，有20個單核菌株的菌絲形態(tài)優(yōu)于其出發(fā)菌株，占單核菌株的48.78%，有10個單核菌株的菌絲形態(tài)與其出發(fā)菌株相似，占單核菌株的24.39%，有11個單核菌株的菌絲形態(tài)劣于其出發(fā)菌株，占單核菌株的26.83%；單核菌株與出發(fā)菌株在菌絲長勢方面均具有一定差異，且不具有一定的規(guī)律性，有6個單核菌株的菌絲長勢優(yōu)于其出發(fā)菌株，占單核菌株的14.63%；有23個單核菌株的菌絲長勢與其出發(fā)菌株相當(dāng)，占單核菌株的56.10%，有12個單核菌株的菌絲形態(tài)劣于其出發(fā)菌株，占單核菌株的29.27%。表2,圖2～5。

表 2 出發(fā)菌株與單核菌株菌絲培養(yǎng)特征
Table 2 The results of variance analysis about starting strains and mononuclear strains

序號No.菌株Strain菌絲長速Growth rate (mm/d)菌落形態(tài)Colony morpology菌絲長勢Growth vigor13389.39a菌絲濃白,邊緣整齊++2338-175.95b菌絲濃白,邊緣不整齊++3338-184.12c菌絲濃白,邊緣不整齊+4338-203.50d菌絲濃白,邊緣不整齊+54575.96c菌絲較濃白,邊緣較整齊++6457-376.68b菌絲濃白,邊緣整齊++7457-306.94a菌絲濃白,邊緣整齊++85044.06b菌絲濃白,邊緣整齊++9504-633.23b菌絲濃白,不整齊++10504-415.44a菌絲稀疏,邊緣不整齊++11504-433.69b菌絲濃白,邊緣較整齊++121 1185.37a菌絲稀疏,邊緣較整齊++131 118-275.22a 菌絲稀疏,邊緣較整齊++141 118-483.39b菌絲稀疏,邊緣較整齊+151 118-335.02a菌絲稀疏,邊緣較整齊++161 7099.19a菌絲稀疏,邊緣不整齊+++171 709-747.74b菌絲濃白,邊緣較整齊+++181 709-1036.82c菌絲稀疏,邊緣整齊+++191 709-597.72b菌絲濃白,邊緣整齊+++203 7788.93b菌絲濃白,邊緣整齊++++213 778-869.41a菌絲濃白,邊緣整齊++++223 778-816.17d菌絲濃白,邊緣整齊++233 778-477.02c菌絲濃白,邊緣整齊+++243 7809.21b菌絲濃白,邊緣整齊+++253 780-209.69a菌絲較濃白,邊緣整齊++++263 780-319.29b菌絲濃白,邊緣較整齊++++273 780-246.76c菌絲濃白,邊緣較整齊+++284 0105.43c菌絲稀疏,邊緣較整齊+++294 010-917.73a菌絲濃白,邊緣整齊+++304 010-134.97d菌絲稀疏,邊緣較整齊++314 010-886.94b菌絲濃白,邊緣整齊++324 0624.95b菌絲稀疏,邊緣不整齊++334 062-683.46c菌絲稀疏,邊緣不整齊+344 062-507.08a菌絲濃白,邊緣整齊++354 062-822.98d菌絲稀疏,邊緣不整齊+364 1006.11b菌絲較濃白,邊緣不整齊++374 100-233.68d菌絲濃白,邊緣整齊++384 100-526.80a菌絲稀疏,邊緣較整齊+++394 100-545.40c菌絲較濃白,邊緣不整齊++404 1319.75a菌絲較濃白,邊緣不整齊++++

續(xù)表 2 出發(fā)菌株與單核菌株菌絲培養(yǎng)特征
Table 2 The results of variance analysis about starting strains and mononuclear strains

序號No.菌株Strain菌絲長速Growth rate (mm/d)菌落形態(tài)Colony morpology菌絲長勢Growth vigor414 131-258.96b菌絲濃白,邊緣整齊++++424 131-247.85c菌絲濃白,邊緣整齊+++434 131-299.41a菌絲濃白,邊緣整齊+++444 1467.69a菌絲較濃白,邊緣較整齊+++454 146-393.83b菌絲稀疏,邊緣不整齊++464 146-267.67a菌絲濃白,邊緣整齊+++474 146-347.65a菌絲濃白,邊緣整齊+++484 4402.69a菌絲濃白,菌落有退化現(xiàn)象+494 440-172.10c菌絲濃白,邊緣不整齊+504 440-992.33b菌絲濃白,邊緣不整齊+514 440-232.61a菌絲濃白,邊緣不整齊+524 4537.60d菌絲稀疏,邊緣較整齊+++534 453-309.37b菌絲濃白,邊緣整齊++++544 453-368.94c菌絲濃白,邊緣整齊++++554 453-879.84a菌絲濃白,邊緣整齊++++

注：* 菌絲長速后面的小寫字母代表顯著性差異(P=0.05)

Note: * The lower case letters behind the hypha growth rate represent significant differences(P=0.05)

圖5 出發(fā)菌株與單核菌株菌絲生長
Fig. 5 Mycelium growth of starting strains and mononuclear strains

3 討 論

研究表明，原生質(zhì)體分離和再生過程本身可作為提高變異的手段，從而在食用菌品種改良和選育上發(fā)揮一定的作用[11-13]。原生質(zhì)體單核是食用菌育種的重要材料，也是直接利用野生資源和栽培種植的重要途徑。研究通過比較發(fā)現(xiàn)，相同條件下，供試菌株在原生質(zhì)體釋放速率、再生能力和單核菌株得率方面存在明顯不同，這可能與供試材料本身所具有的生物學(xué)特征特性不同有關(guān)，如細(xì)胞壁厚度不同、細(xì)胞壁疏密度不同、胞壁再生能力不同等。此外，在原生質(zhì)體制備過程中，機(jī)械震蕩、化學(xué)試劑處理均可能導(dǎo)致控制生長性狀的基因丟失或發(fā)生變異，從而導(dǎo)致了再生菌株菌落形態(tài)、生長速度和其它生物學(xué)特性的改變[14]。研究通過分析比較單核菌株與其出發(fā)菌株菌落培養(yǎng)特征發(fā)現(xiàn)，來自同一出發(fā)菌株的各個單核化菌株之間以及不同出發(fā)菌株的各個單核化菌株間，菌落培養(yǎng)特征在形態(tài)、長速、長勢等方面均表現(xiàn)出了豐富的多樣性。雖然有關(guān)供試菌株分子水平的遺傳多樣性還有待進(jìn)一步研究，但研究進(jìn)行野生平菇原生質(zhì)體制備和再生的規(guī)律，并對再生菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為野生平菇原生質(zhì)體再生后代的遺傳多樣性研究提供豐富的材料。為了推動平菇產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康的發(fā)展，必須加強(qiáng)平菇優(yōu)良品種的選育研究[15-16]。

4 結(jié) 論

各菌株原生質(zhì)體釋放量隨酶解時間延長呈先升高再降低的趨勢，11個菌株在酶解處理3.5 h時原生質(zhì)體釋放量最大，占總數(shù)的的84.6%；不同菌株原生質(zhì)體再生能力存在差異，其中菌株4 453的原生質(zhì)體再生率最高；供試的19株平菇菌株共獲得單核菌株81個，其中菌株4 062獲得的單核數(shù)量最多；菌株4 181、4 159、4 072、1 105單核得率最低，都僅獲得1個單核，結(jié)果表明供試菌株原生質(zhì)體單核率較低，有待提高；比較分析出發(fā)菌株與其單核菌株的菌絲培養(yǎng)特征發(fā)現(xiàn)，單核菌株與出發(fā)菌株在菌絲長速、形態(tài)、長勢等方面均具有一定差異，但不具有一定的規(guī)律性，12個單核菌株的菌絲長速顯著高于其出發(fā)菌株，有20個單核菌株的菌絲形態(tài)優(yōu)于其出發(fā)菌株，有6個單核菌株的菌絲長勢優(yōu)于其出發(fā)菌株。所有供試菌株在原生質(zhì)體釋放速率、單核得率以及菌絲長速、長勢、菌落形態(tài)等方面具有豐富的遺傳多樣性。