UbcH10在肝癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

田明 常偉平

摘要：目的? 探討UbcH10在肝癌中的臨床病理特征及預(yù)后意義。方法? 采用RT-PCR技術(shù)對(duì)我院2017年9月～12月收治的30例不同分化程度肝癌患者腫瘤組織中的UbcH10表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Kaplan-Meier和 Cox回歸評(píng)估UbcH10表達(dá)與患者存活率的相關(guān)性。結(jié)果? 低分化肝癌組織中UbcH10 mRNA表達(dá)EI評(píng)分為（0.82±0.32）分，高于高分化癌組織的（0.33±0.06）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同組織學(xué)分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的UbcH10表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高UbcH10表達(dá)和低UbcH10表達(dá)的肝癌患者的存活時(shí)間不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? UbcH10可能在腫瘤發(fā)展中起積極作用，可作為肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

關(guān)鍵詞：UbcH10;肝癌;預(yù)后

中圖分類號(hào)：R735.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.12.024

文章編號(hào)：1006-1959（2019）12-0077-03

Abstract：Objective? To investigate the clinicopathological features and prognostic significance of UbcH10 in hepatocellular carcinoma. Methods? The expression of UbcH10 in tumor tissues of 30 patients with different degrees of differentiation from September to December 2017 was detected by RT-PCR.Correlation between UbcH10 expression and patient survival was assessed by Kaplan-Meier and Cox regression. Results? The EI score of UbcH10 mRNA expression in poorly differentiated liver cancer tissues was （0.82±0.32）， which was higher than that in well differentiated cancer tissues（0.33±0.06）， the difference was statistically significant （P<0.05）.The difference of UbcH10 expression between patients with different histological differentiation and lymph node metastasis was statistically significant （P<0.05）. The survival time of patients with high UbcH10 expression and low UbcH10 expression was different，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? UbcH10 may play an active role in tumor development and may be an independent predictor of poor prognosis in patients with liver cancer.

Key words：UbcH10;Liver cancer;Prognosis

肝癌（liver cancer）是我國(guó)高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤之一。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌患者的平均5年生存率僅為4%[1]。肝癌患者一般確診時(shí)已至晚期，臨床治療手段非常有限，患者預(yù)后極差[2]。目前，肝癌的預(yù)后生物標(biāo)志物相對(duì)缺乏，尋找有效的預(yù)后標(biāo)記具有重大意義。在本研究主要探討肝癌組織中UbcH10的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，分析肝癌患者UbcH10的表達(dá)與生存率相關(guān)性的，旨在尋找肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

1資料與方法

1.1一般資料? 收集2017年9月～12月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診，接受手術(shù)切除術(shù)或組織活檢的肝癌患者30例，其中男性18 例，女性12例，年齡31～81 歲，中位年齡59年。所有患者術(shù)前均進(jìn)行了超聲檢查和計(jì)算機(jī)斷層掃描。21例患者中行根治性切除，9例患者接受了姑息性手術(shù)，手術(shù)前后均未進(jìn)行化療或放療。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的分類，8例高分化腫瘤，22例為中度或低分化腫瘤。本研獲得患者同意并獲得研究所研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1 RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR? 在取得組織樣本后在液氮中快速冷凍， -80℃下儲(chǔ)存。通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)30例肝癌組織中的UbcH10基因表達(dá)。根據(jù)說(shuō)明書（TRIzol，Invitrogen，USA）提取總RNA。將RNA（2 μg）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（Promega，Madison，WI）。使用Mastercycler? ?ep realplex （Eppendorf， Hamburg， Germany）和IQTM SYBR Green SupermixKit（BIORAD，Berkeley，CA）根據(jù)制造商的方案評(píng)估定量UbcH10 mRNA水平。GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照。qPCR引物如下：UbcH10，有義5'-GGCCCC TTTGGCCAAATGATTAATTACTTAC-3和反義5'-GTTGCCAATTGGACTTGAAGCTTCAATT-3';GAPDH，感覺(jué)5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'和反義5'- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。循環(huán)條件如下：95℃ 2 min，然后40個(gè)循環(huán)95℃ 15 s，59℃ 30 s和72℃ 45 s，最終延伸72℃ 5 min。每個(gè)反應(yīng)一式三份進(jìn)行。UbcH10的表達(dá)水平表示為2-△△CT，其中ΔCt=Ct（UbcH10）-Ct（GAPDH）。

1.2.2免疫組化分析? 通過(guò)免疫組織化學(xué)證實(shí)檢測(cè)肝癌組織中的UbcH10蛋白表達(dá)。使用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物方法固定，石蠟包埋，3 μm厚的組織切片。將切片脫石蠟并使用分級(jí)系列的乙醇溶液脫水。通過(guò)與0.3%氫過(guò)氧化物酶和甲醇一起溫育20 min來(lái)終止內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中漂洗后，將組織切片在耐熱塑料容器內(nèi)的0.01 M檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0） 中處理。然后將切片在家用微波爐中照射20 min微波輻射后，使載玻片在室溫下冷卻。第一抗體是對(duì)UbcH1 特異的兔抗體（1：15， Atlas Antibodies，Sigma-Aldrich，USA）。將切片與一抗孵育過(guò)夜4℃，然后使用二抗，用二氨基聯(lián)苯胺顯示結(jié)果。由兩名在免疫組織化學(xué)方面經(jīng)驗(yàn)豐富的獨(dú)立觀察者載玻片，使用基于染色程度的視覺(jué)分級(jí)系統(tǒng)對(duì)UbcH10表達(dá)進(jìn)行定量分析。陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分比分級(jí)為0～3： 0=陰性，1=1%～30%，2=31%～60%，3>60%。染色強(qiáng)度分級(jí)為0～3：0=無(wú)，1=弱染色，2=中度染色，3=強(qiáng)染色。程度（E）和強(qiáng)度（I）的組合通過(guò)E×I的乘積獲得染色，每個(gè)斑點(diǎn)從0～9變化。計(jì)算每個(gè)肝癌樣本的平均EI得分。EI 評(píng)分在0～3分為低表達(dá)，EI評(píng)分>3分為高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，？字2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)用于分析UbcH10表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，使用Kaplan-Meier方法繪制存活曲線，使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)比較UbcH10表達(dá)的情況，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估存活情況。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 UbcH10基因在高低分化組織中的表達(dá)? 低分化肝癌組織中UbcH10 mRNA表達(dá)EI評(píng)分為（0.82±0.32）分，高于高分化癌組織的（0.33±0.06）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 UbcH10基因表達(dá)與肝癌的臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系分析? 不同UbcH10表達(dá)肝癌患者的年齡、性別、手術(shù)類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;不同UbcH10表達(dá)肝癌患者組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3肝癌患者的總生存率與UbcH10表達(dá)水平的關(guān)系? 高UbcH10表達(dá)和低UbcH10表達(dá)肝癌患者間的存活時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與低UbcH10表達(dá)組相比，高UbcH10表達(dá)肝癌患者的存活期較短，見(jiàn)圖2。

3討論

肝癌標(biāo)志物檢測(cè)是對(duì)影像學(xué)及病理學(xué)診斷有益的補(bǔ)充，目前肝癌標(biāo)志物檢測(cè)主要目的在于提前發(fā)現(xiàn)腫瘤或腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，以便及時(shí)治療，但是能夠提示患者預(yù)后的標(biāo)志物較少。AFP異質(zhì)體是一種新型的肝癌標(biāo)志物，其含量高低與肝癌的分化程度密切相關(guān)，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的肝癌檢測(cè)標(biāo)志物，Marrero JA等[3]研究顯示，相比肝硬化患者，AFP能更好的檢測(cè)肝癌，另外，TGF-β也可以作為檢測(cè)肝癌有效手段之一。Yi X[4]等研究指出，AFP-L3 診斷肝癌的靈敏度為48.3%，特異度為92.9%，因其早期診斷肝細(xì)胞癌的靈敏度和特異度均較高，可作為肝癌細(xì)胞患者早期診斷的指標(biāo)之一。

UbcH10是泛素結(jié)合酶家族的成員，是泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑的關(guān)鍵介質(zhì)。大量證據(jù)表明，UbcH10在各種類型的惡性腫瘤中異常過(guò)表達(dá)，包括乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、淋巴瘤、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌[5-8]。本次研究中，在中低分化肝癌組織中，UbcH10的基因表達(dá)水平高于高分化肝癌組織（P<0.05）。在調(diào)查了肝癌中UbcH10的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示UbcH10表達(dá)上調(diào)與組織學(xué)分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)高UbcH10表達(dá)的肝癌患者存活持續(xù)時(shí)間短于低UbcH10 表達(dá)患者，這些結(jié)果均提示UbcH10可能作為肝癌預(yù)后的優(yōu)良標(biāo)志物，其可成為目前肝癌腫瘤標(biāo)記物研究有益的補(bǔ)充。

本次研究結(jié)果顯示，UbcH10表達(dá)水平在不同手術(shù)類型患者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明可能需要更多的肝癌組織樣本來(lái)評(píng)估UbcH10過(guò)表達(dá)與手術(shù)類型之間的關(guān)系。

總之，本研究可證明UbcH10表達(dá)與肝癌患者預(yù)后高度相關(guān)，UbcH10可能作為肝癌患者腫瘤治療的預(yù)后標(biāo)志物和潛在分子靶點(diǎn)。

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收稿日期：2019-3-10;修回日期：2019-4-28

編輯/成森