8-氨基異紫堇堿對(duì)HO-8910PM增殖和遷移的抑制作用

紀(jì) 武，王圣坦，朱根海，賀國(guó)麗，洪 瀾，王 雁

卵巢癌(ovarian carcinoma,OC)發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期[1]。近年來(lái)中草藥的天然有效成分抗癌效果引起了廣泛關(guān)注[2]，其中8-氨基異紫堇堿(8-amino-isocorydine,8-NH2-ICD)是從罌粟科植物禿瘡花中提取的以異紫堇堿為原料，經(jīng)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)衍生合成而來(lái)，通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步修飾。研究[3]顯示，8-NH2-ICD可抑制人肺癌(A549)、胃癌(SGC7901)、肝癌(HepG2)細(xì)胞系體外生長(zhǎng)，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明異紫堇堿類(lèi)衍生物為一種有效的抗癌劑且具有更低的毒副作用。該研究從腫瘤細(xì)胞增殖及遷移方面，探討8-NH2-ICD對(duì)體外培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移卵巢癌-8910PM(human high metastatic ovarian carcinoma-8910PM,HO-8910PM)細(xì)胞株的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人上皮OC細(xì)胞株HO-8910PM由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供，純度>99%，以高糖型DMEM(美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)液，加入10%標(biāo)準(zhǔn)胚牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)、青-鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司)，放置在37 ℃、5% CO2及飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)消化傳代。

1.1.2主要儀器與試劑 酶標(biāo)儀(Promega多功能化學(xué)發(fā)光儀)購(gòu)自美國(guó)普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡(Axio Observer A1)購(gòu)自德國(guó)Lecia公司；FACS Calibur Cell Sorting System型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Yeasen公司；細(xì)胞凋亡Hoechst染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OC細(xì)胞株HO-8910PM進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、藥物組，陰性對(duì)照組不經(jīng)藥物處理，僅加10% FBS培養(yǎng)液，藥物組中藥物濃度梯度依次為5、10、20、40 μg/ml。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 在1.1.1 所述條件下對(duì)人上皮性O(shè)C細(xì)胞HO-8910PM進(jìn)行培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞密度1×105個(gè)/ml，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)12 h見(jiàn)細(xì)胞貼壁后加入配置好的工作濃度藥液，各藥物濃度均設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，陰性對(duì)照組只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞。于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔吸光度(optical density,OD)值，空白對(duì)照孔為調(diào)零孔。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-藥物組OD值)/陰性對(duì)照組OD值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Hoechst染色觀察HO-8910PM細(xì)胞凋亡形態(tài) 將生長(zhǎng)穩(wěn)定的HO-8910PM細(xì)胞傳代至6孔板中(底部放置一蓋玻片)，每孔細(xì)胞數(shù)量約105個(gè)，培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁并覆蓋培養(yǎng)孔50%時(shí)，分別按陰性對(duì)照組、8-NH2-ICD 5、10、20、40 μg/ml 5個(gè)分組方式加藥處理至72 h，應(yīng)用Hoechst染色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，染色5 min吸去染色液，蓋上有細(xì)胞的蓋玻片制備臨時(shí)裝片并觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)固縮，Hoechst染色時(shí)細(xì)胞核呈致密濃染或碎塊致密濃染。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將培養(yǎng)細(xì)胞HO-8910PM以1×105個(gè)/ml密度接種在6孔板上，吸去培養(yǎng)基，加入2 ml 1640培養(yǎng)液及不同濃度8-NH2-ICD的1640培養(yǎng)液，每孔設(shè)立2個(gè)復(fù)孔。作用24 h后離心收集細(xì)胞，應(yīng)用PBS洗滌1次，加入預(yù)冷70%乙醇固定過(guò)夜；第2天以2 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌1次，以0.5 ml PBS重懸，按照Cycle Test-Plus DNA Reagent Kit(美國(guó)BD公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，以注射器吸取細(xì)胞懸液，經(jīng)尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀，應(yīng)用Mod Fit LT軟件分析各樣品中細(xì)胞周期分布情況。

1.2.5Transwell小室測(cè)定細(xì)胞遷移能力 將Matrigel以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至50 μg/ml，每小室加50 μl，4 ℃冰箱過(guò)夜風(fēng)干，第2天在超凈臺(tái)照射2 h，加入100 μl含10 μg/L牛血清白蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)液濕化，對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，其他各組加入不同濃度8-NH2-ICD，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，參照鄭愛(ài)文等[4]提出的方法評(píng)估細(xì)胞侵襲能力。本研究選擇陰性對(duì)照組、藥物組中40 μg/ml 8-NH2-ICD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)結(jié)果隨時(shí)間、藥物濃度增加，HO-8910PM細(xì)胞增殖抑制率增加(P<0.05)，在5～20 μg/ml范圍內(nèi)有明顯量效、時(shí)效關(guān)系，至20 μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用基本已達(dá)最大值。見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察結(jié)果細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后，于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞呈彌散均勻的淡藍(lán)色熒光，添加8-NH2-ICD的細(xì)胞株出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、熒光致密發(fā)亮、大小不同顆粒狀強(qiáng)藍(lán)色熒光等凋亡形態(tài)變化(如箭頭所示)，尤其隨8-NH2-ICD濃度增加，凋亡進(jìn)程加快，染色質(zhì)凝聚現(xiàn)象及凋亡小體明顯增多，凋亡小體釋放增多，細(xì)胞膜變形更明顯。見(jiàn)圖1。

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，8-NH2-ICD作用72 h后，與陰性對(duì)照組比較，濃度在5～20 μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞周期作用不明顯，濃度為40 μg/ml時(shí)S期細(xì)胞減少，G0/G1期細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，8-NH2-ICD對(duì)HO-8910PM細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。見(jiàn)表2、圖2。

表1 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)結(jié)果

同一濃度與24 h比較：*P<0.05；同一濃度與48 h比較：#P<0.05；同一時(shí)點(diǎn)與5 μg/ml比較：△P<0.05；同一時(shí)點(diǎn)與10 μg/ml比較：▲P<0.05；同一時(shí)點(diǎn)與20 μg/ml比較：☆P<0.05

表2 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05

圖1 培養(yǎng)72 h后
Hoechst染色結(jié)果×200

A：陰性對(duì)照組；B：8-NH2-ICD 5 μg/ml藥物組；C：8-NH2-ICD 10 μg/ml藥物組；D：8-NH2-ICD 20 μg/ml藥物組；E：8-NH2-ICD 40 μg/ml藥物組

表3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)結(jié)果個(gè)/視野,n=3)

與24 h比較：*P<0.05；與48 h比較：#P<0.05

2.4 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)結(jié)果Transwell小室檢測(cè)結(jié)果顯示，處理24、48、72 h時(shí)藥物組侵襲至濾鏡下表面的細(xì)胞數(shù)明顯減少，且均低于陰性對(duì)照組，尤其是48、72 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

3 討論

OC發(fā)病率僅次于宮頸癌、乳腺癌，尋找新的治療方案迫在眉睫[5]。我國(guó)藥材資源豐富，尤其是西北地區(qū)天然草藥及其有效成分的抗病毒、抗癌效果已得到廣泛關(guān)注，其中禿瘡花具有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲(chóng)等功能，含有異紫堇堿、紫堇堿等活性成分[6]，研究[7]表明異紫堇堿不僅通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制肝癌細(xì)胞增殖，也能通過(guò)靶向誘導(dǎo)耐藥性側(cè)群細(xì)胞相關(guān)因子凋亡，但其有效劑量200 μmol/L于臨床治療而言為相對(duì)高劑量，為減少異紫堇堿劑量及改進(jìn)抗癌活性，將異紫堇堿通過(guò)化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)改造得到8-NH2-ICD。

8-NH2-ICD屬于前期篩選的異紫堇堿衍生物，易溶于水，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，已有研究[8]表明8-NH2-ICD對(duì)人乳腺癌細(xì)胞、子宮頸癌細(xì)胞等癌細(xì)胞均有不同程度抑制作用。本研究選擇了具有較強(qiáng)侵襲及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)潛能的人OC細(xì)胞株HO-8910PM進(jìn)行研究，結(jié)果顯示隨時(shí)間、8-NH2-ICD藥物濃度增加，HO-8910PM細(xì)胞增殖抑制率增加，在5～20 μg/ml范圍內(nèi)有明顯量效、時(shí)效關(guān)系，至20 μg/ml時(shí)8-NH2-ICD對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用基本已達(dá)最大值，表明8-NH2-ICD對(duì)人OC細(xì)胞株HO-8910PM有明顯抑制作用，且在5～20 μg/ml范圍內(nèi)呈時(shí)間與劑量依賴(lài)性，20 μg/ml時(shí)抑制作用最大，可將其作為理想治療劑量。

細(xì)胞凋亡是多種細(xì)胞調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，本研究中Hoechst 33258染色顯示，添加8-NH2-ICD的細(xì)胞株細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮、熒光致密發(fā)亮等凋亡形態(tài)變化，隨8-NH2-ICD濃度增加，凋亡進(jìn)程加快，染色質(zhì)凝聚現(xiàn)象及凋亡小體明顯增多，細(xì)胞膜變形更明顯，因此8-NH2-ICD可較好促進(jìn)HO-8910PM細(xì)胞凋亡，這與梁雪霏[9]的研究結(jié)論相近。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，8-NH2-ICD作用72 h后，與陰性對(duì)照組相比，濃度在5～20 μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞周期作用不明顯，濃度為40 μg/ml時(shí)S期細(xì)胞減少，G0/G1期細(xì)胞比例增加， 8-NH2-ICD將HO-8910PM細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，這可能是因?yàn)樵撈诩?xì)胞多處于DNA合成前期，絕大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期，從而使細(xì)胞不能進(jìn)入S期及G2/M期進(jìn)行DNA合成，細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入下一個(gè)合成周期，因此較好地抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移特性為腫瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)特征[10]，本研究表明，處理24、48、72 h時(shí)40 μg/ml藥物組侵襲至濾鏡下表面的細(xì)胞數(shù)明顯減少，且均低于陰性對(duì)照組，與閆倩[11]報(bào)道的8-NH2-ICD經(jīng)異紫堇堿結(jié)構(gòu)修飾后抗癌活性提高，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)論相符。因此8-NH2-ICD能有效抑制人OC細(xì)胞株HO-8910PM的遷移，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)[12]，鑒于本研究HO-8910PM細(xì)胞株數(shù)量少，關(guān)于其作用機(jī)制仍有待深入研究。

圖2 培養(yǎng)72 h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

A：陰性對(duì)照組；B：8-NH2-ICD 5 μg/ml藥物組；C：8-NH2-ICD 10 μg/ml藥物組；D：8-NH2-ICD 20 μg/ml藥物組；E：8-NH2-ICD 40 μg/ml藥物組

圖3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)結(jié)果 ×200

A：陰性對(duì)照組；B：8-NH2-ICD 5 μg/ml藥物組；C：8-NH2-ICD 10 μg/ml藥物組；D：8-NH2-ICD 20 μg/ml藥物組；E：8-NH2-ICD 40 μg/ml藥物組

本實(shí)驗(yàn)研究表明，8-NH2-ICD能通過(guò)將人OC細(xì)胞株HO-8910PM阻滯于G0/G1期而可較好抑制細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，這為OC的治療提供了新途徑。