板栗鐵型超氧化物歧化酶基因(CmFeSOD)的克隆及原核表達(dá)

韓 珊，劉裕峰，朱天輝，劉應(yīng)高，譙天敏， 李姝江，汪煜伶，徐纓絡(luò)，莫義英

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，成都 611130)

板栗(CastaneamollissimaBl)，又名栗，屬殼斗科栗屬堅(jiān)果類植物，起源于中國，歷史悠久，是中國的特產(chǎn)植物，也是世界上重要的干果植物之一。栗疫病(Chestnut blight)的出現(xiàn)，使美洲板栗遭到幾乎滅絕的威脅，歐洲板栗也遭受巨大的危害[14]。中國板栗是對(duì)栗疫病抗病性最好的種[15]，這可能是由于其與栗疫病菌[Cryphonectriaparasitica(Murrill) Barr.]共演化的結(jié)果[16]。本試驗(yàn)對(duì)板栗CmFeSOD基因的克隆及原核表達(dá)進(jìn)行研究，為揭示CmFeSOD基因與抗栗疫病之間的分子機(jī)制，并為利用基因工程技術(shù)培育抗病性林木提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

板栗品種‘石豐’由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院崇州基地提供。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取100 mg健康板栗幼葉(生長3個(gè)月)，利用液氮充分研磨后，使用植物總RNA提取試劑盒(GK型，北京華越洋生物科技有限公司，中國)提取總RNA，提取的RNA通過紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)量濃度和純度；參照公司PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(6210A，TaKaRa，日本)的操作說明書，合成第一鏈 cDNA。

1.3 CmFeSOD基因的克隆

對(duì)板栗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(http://www.fagaceae.org/)和 GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已報(bào)道的其他植物SOD 基因序列進(jìn)行 Blast 序列比對(duì)，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物CmFeSOD-F1：5′-ATGGCTTTCCGGCCTCTAT-3′和CmFeSOD-R1：5′-TCAAGGGCATTCTTTCTCA-3′。以cDNA(2 μg/μL)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸 7 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取目的片段，使用膠回收試劑盒(DP209，天根生化科技有限公司，中國)進(jìn)行純化回收，回收片段與 pMD19-T 載體(TaKaRa，日本)連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于Amp/X-gal/LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取經(jīng)PCR鑒定后的陽性克隆菌液，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.4 CmFeSOD基因序列的生物信息學(xué)分析

利用軟件DNAMAN(Ver.6.0，Lynnon biosoft，美國)查找序列的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，并將其翻譯為氨基酸序列，通過NCBI中的Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對(duì)。分別運(yùn)用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)和ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)和疏水性進(jìn)行分析。利用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite)對(duì)其編碼蛋白的功能位點(diǎn)及功能域進(jìn)行分析，通過SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。分別使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)其編碼蛋白的跨膜區(qū)和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html)進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用MEGA(Ver.6.0，Research center for genomics and bioinformatics，日本)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)板栗CmFeSOD基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物CmFeSOD-F2：5′-CGGGATCCATGGCTTT- CCGGCCTCTAT-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))和CmFeSOD-R2：5′-CCCAAGCTTTCA-AGGGCATTCTTTCTCA-3′(下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn))。以 pMD19-T-CmFeSOD質(zhì)粒為模板(2 μg/μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序同“1.3”。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行目的片段純化回收。以 pET-28a 作為表達(dá)載體，對(duì)回收片段進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，使用T4DNA連接酶 16 ℃連接 12 h。將獲得的 pET28a-CmFeSOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EscherichiacoliBL21(DE3)進(jìn)行卡那霉素(Kanamycin,Kan)(100 μg/mL)抗性篩選，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，提取陽性克隆菌液質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.6 CmFeSOD蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測

挑取含有pET28a-CmFeSOD重組質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落，接種于含Kan(100 μg/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫 37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng) 12 h。按體積比1∶100進(jìn)行菌液擴(kuò)增培養(yǎng)，當(dāng)菌液光密度OD600約為0.6～0.8時(shí)，分別進(jìn)行不同條件的誘導(dǎo)。首先進(jìn)行不同濃度(終濃度為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和 1.0 mmol/L)的IPTG誘導(dǎo) 3 h，再進(jìn)行不同時(shí)間長度(1 h、2 h、3 h、 4 h、5 h和6 h)的誘導(dǎo)，最后進(jìn)行不同溫度 (25 ℃、30 ℃和 37 ℃)的誘導(dǎo)，收集1 mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，篩選最優(yōu)條件，并對(duì)不同溫度誘導(dǎo)下的目的蛋白進(jìn)行可溶性分析。所有樣品檢測均以IPTG誘導(dǎo)的pET28a-BL21(DE3)和未誘導(dǎo)的pET28a-BL21(DE3)、pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗CmFeSOD基因的克隆與序列分析

利用特異性引物CmFeSOD-F1和CmFeSOD-R1對(duì)板栗cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與預(yù)期片段大小相符的單一條帶(圖 1)，回收該片段與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化后，經(jīng)菌落PCR檢測發(fā)現(xiàn)相同大小的條帶(圖 2)。測序表明板栗CmFeSOD基因序列長度為 705 bp(圖 3)。通過DNAMAN分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的cDNA序列無非編碼區(qū)，為一個(gè)完成的ORF，編碼 234 個(gè)氨基酸。該核苷酸序列與GenBank中已報(bào)道的SOD基因序列的Blastn比對(duì)結(jié)果表明，該片段堿基序列與白樺(KP711291.1)、煙草(X14482.1)等植物SOD基因cDNA序列的一致性為82%～90%。表明該基因?qū)儆诔趸锲缁富蚣易宄蓡T之一，將該基因cDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)：KY312852，命名為CmFeSOD基因。

2.2 CmFeSOD蛋白的氨基酸序列分析

采用ProtParam軟件推算CmFeSOD蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為26.016 5 ku，理論等電點(diǎn)為6.86，該蛋白由20 種氨基酸組成，其中以亮氨酸(Leu)使用最為頻繁，占氨基酸總量的12.0%，以半胱氨酸(Cys)使用最少，僅占氨基酸總量的0.4%。

1.CmFeSO基因PCR產(chǎn)物 PCR products ofCmFeSODgene; M.DNA marker(DL2000，Takara，Japan)

圖1 板栗葉組織中CmFeSOD基因的PCR擴(kuò)增
Fig.1 PCR amplification ofCmFeSODgene from leaf tissue of chestnut

M.DNA marker(DL2000，Takara，Japan); 1～5.pMD19-T-CmFeSOD-DH5α PCR產(chǎn)物 PCR products of pMD19-T-CmFeSOD-DH5α

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T-CmFeSOD-DH5αPCR檢測
Fig.2 Detection ofCmFeSODgene in arecombinant plasmid of pMD19-T-CmFeSOD-DH5α based on PCR amplification

CmFeSOD蛋白具有酸性氨基酸21個(gè)，堿性氨基酸20個(gè)，分別占氨基酸總量的8.97%和8.55%，推算其分子式為C1178H1813N317O342S4。預(yù)測該蛋白為穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)為34.87)，脂肪系數(shù)為89.62，平均親水系數(shù)為-0.323，屬親水性蛋白。由圖4可見，CmFeSOD蛋白具有Sod_Fe_C、Sod_Fe_N、PLN02471和SodA結(jié)構(gòu)域，這些區(qū)域均為SOD蛋白家族特有的保守功能域。利用Prosite工具發(fā)現(xiàn)鐵錳超氧化物歧化酶信號(hào)位點(diǎn)(Manganese and iron superoxide dismutase signal site)-DVWEHAYY，位于蛋白序列的第195～202氨基酸。氨基酸序列同源性及多重序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，CmFeSOD蛋白與其他植物SOD蛋白序列一致性較高，均在80%以上。遺傳進(jìn)化分析表明，板栗與核桃親緣關(guān)系較近，可能由同一個(gè)始祖進(jìn)化而來(圖6)。

加粗字體表示起始密碼子 Blod fonts indicated start codon; *表示終止密碼子 Asterisk indicated stop codon; 下劃線表示鐵錳超氧化物歧化酶信號(hào)位點(diǎn) Capital letters underlined using single line indicated signal site of iron-manganese superoxide dismutase

圖3CmFeSOD基因的cDNA序列及其所推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.3 cDNA sequence and deduced amino acid sequence ofCmFeSODgene

圖4 CmFeSOD蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domains of CmFeSOD protein

2.3 CmFeSOD蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

是否具有蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域?qū)τ诹私獾鞍椎慕Y(jié)構(gòu)、功能、方位以及在細(xì)胞中的作用部位有重要意義，CmFeSOD蛋白的跨膜區(qū)域分析顯示，該蛋白不存在跨膜區(qū)域，推測其存在于細(xì)胞質(zhì)中。信號(hào)肽的分析有助于認(rèn)識(shí)和了解該蛋白是否參與跨膜轉(zhuǎn)移，CmFeSOD蛋白信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白。蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞構(gòu)成蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈，這些部分是蛋白質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)其功能和構(gòu)象的主要區(qū)域，CmFeSOD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由35.90%的α-螺旋，31.20%的無規(guī)則卷曲，20.09%的延伸鏈和12.81%的β-轉(zhuǎn)角組成(圖7-a)。利用HhblitsS工具發(fā)現(xiàn)CmFeSOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)同源模板為擬南芥AtSOD蛋白(4c7u.1)，其與CmFeSOD蛋白序列相似性達(dá)86%，覆蓋率為85%，利用WISS-MODEL在線軟件構(gòu)建CmFeSOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7-b)。

2.4 pET28a-CmFeSOD重組載體的構(gòu)建

使用帶酶切位點(diǎn)的引物CmFeSOD-F2和CmFeSOD-R2，以pMD19-T-CmFeSOD質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增CmFeSOD基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測到預(yù)期大小的片段并純化回收，將目的片段與pET-28a載體分別進(jìn)行BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，分別回收酶切后的目的片段與載體，使用T4DNA連接酶連接并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定(圖8、圖9)。

2.5 CmFeSOD蛋白原核表達(dá)的SDS-PAGE 分析

在37 ℃下進(jìn)行不同IPTG濃度(終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) 3 h，以未誘導(dǎo)的pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)、pET28a-BL21(DE3)以及加入至終濃度為0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h后的pET28a-BL21(DE3)空載體作為對(duì)照。經(jīng)蛋白電泳發(fā)現(xiàn)，pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)在不同濃度下均能誘導(dǎo)出大量的目的蛋白(圖10)，目的蛋白大小約為29 ku。預(yù)測CmFeSOD蛋白分子質(zhì)量為26.016 5 ku，外加3 ku pET28a 6*his標(biāo)簽序列，約為29 ku，與表達(dá)的目的蛋白大小相符。同時(shí)，隨著IPTG濃度增加，目的蛋白的表達(dá)量在緩慢增長，當(dāng)IPTG終濃度達(dá)到0.4 mmol/L后，表達(dá)量達(dá)到最大。因此，以終濃度為0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)最佳。

黑底白字表示完全一致的氨基酸序列 White lefferings with black background indicated a complete identical amino acid sequences; 白底黑字表示高度保守的氨基酸序列 Black lefferings with white background represented highly conserved amino acid sequences; 白底灰字表示非保守的氨基酸序列 Gray fonts highlighted with white background represented non-conservative amino acid sequences; α-螺旋顯示為大波浪曲線 α-helix was displayed as large squiggles; η-螺旋顯示為小波浪曲線 η-helix was displayed as small squiggles; 嚴(yán)格的β-轉(zhuǎn)角呈現(xiàn)為TT字母 Strict β-turn was shown as TT letters; β-鏈呈現(xiàn)為箭頭 β-strand was rendered as black solid arrows

圖5 CmFeSOD蛋白與其他植物SOD蛋白的多重序列對(duì)比
Fig.5 Multiple sequence alignment of deduced protein of CmFeSOD with SOD proteins of other plants

圖6 Neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建CmFeSOD蛋白與其他植物SOD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree between CmFeSOD protein and SOD proteins of other plants based on Neighbor-Joining (NJ) method

a.CmFeSOD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) Secondary stucture of CmFeSOD protein; 藍(lán)色表示α-螺旋 Blue color indicated alpha helix; 紫色表示無規(guī)則卷曲 The purple color indicated random coil; 紅色表示延伸鏈 Red color indicated extended strand; 綠色表示β-轉(zhuǎn)角 Green color indicated beta turn；b.CmFeSOD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu) Tertiary structure of CmFeSOD protein

圖7 CmFeSOD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測
Fig.7 Predicted secondary and tertiary structures of CmFeSOD protein

在37 ℃、0.4 mmol/L IPTG條件下，進(jìn)行不同時(shí)間長度(0、1、2、3、4、5、6 h)的誘導(dǎo)。由圖11可見，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢，誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到3 h以后趨于平穩(wěn)，達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)在37 ℃、0.4 mmol/L IPTG條件下的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3 h。

為確定融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最適溫度，并評(píng)估在不同溫度條件下誘導(dǎo)的融合蛋白可溶性。pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)以終濃度為0.4 mmol/L IPTG分別在25 ℃、30 ℃和37 ℃下誘導(dǎo)3 h。SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在不同溫度條件下，除對(duì)照外均能誘導(dǎo)出目的蛋白。pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)在不同溫度條件下所表達(dá)的目的蛋白均以包涵體形式存在，在 30 ℃誘導(dǎo)條件下獲得的包涵體最豐富(圖12)。因此，30 ℃為最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)溫度。

M.DNA marker(DL2000，Takara，Japan); 1～4.pET28a-CmFeSOD-DH5α PCR產(chǎn)物 PCR products of pET28a-CmFeSOD-DH5α

圖8 重組質(zhì)粒pET28a-CmFeSOD-DH5α的PCR檢測
Fig.8 Detection of pET28a-CmFeSOD-DH5αbased on PCR amplification

M.DNA marker(DL2000，Takara，Japan); 1.pET28a-CmFeSOD雙酶切產(chǎn)物 Product of pET28a-CmFeSODdigested by double endonucleases,BamHⅠ/HindⅢ; 2.未酶切pET28a-CmFeSODUndigested pET28a-CmFeSOD

圖9 pET28a-CmFeSOD雙酶切鑒定
Fig.9 Identification of pET28a-CmFeSODdigestedby double endonucleases,BamHⅠ/HindⅢ

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Protein molecular mass marker; 1.pET28a-BL21(DE3)未誘導(dǎo) pET28a-BL21 (DE3) without IPTG; 2.pET28a-BL21(DE3)誘導(dǎo) (IPTG終濃度為0.6 mmol/L) Induction of pET28a-BL21 (DE3) with 0.6 mmol/L IPTG; 3～8.終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) Induction of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) with 0,0.2 mmol/L ,0.4 mmol/L ,0.6 mmol/L ,0.8 mmol/L ,1.0 mmol/L IPTG,respectively.

圖10 融合蛋白pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)誘導(dǎo)濃度優(yōu)化
Fig.10 Optimal concentration of fusion proteinpET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) induced bydifferent concentrations of IPTG

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Protein molecular mass marker; 1.pET28a-BL21(DE3)未誘導(dǎo) pET28a-BL21 (DE3) without IPTG; 2.pET28a-BL21(DE3)誘導(dǎo) (IPTG終濃度為0.4 mmol/L) 3 h pET28a-BL21 (DE3) was induced by IPTG of a concentration of 0.4 mmol/L for 3 h ; 3～9.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)誘導(dǎo)0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced for 0 h,1 h,2 h,3 h,4 h,5 h,6 h,respectively.

圖11 融合蛋白pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化
Fig.11 Optimal time of fusion protein pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) inducedin different length of time

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Protein molecular mass marker; 1.pET28a-BL21(DE3)未誘導(dǎo) Induction of pET28a-BL21(DE3) without IPTG; 2.pET28a-BL21(DE3)誘導(dǎo) (IPTG終濃度為0.4 mmol/L) 3 h pET28a-BL21 (DE3) was induced by IPTG of a concentration of 0.4 mmol/L for 3 h; 3.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)未誘導(dǎo) pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) without IPTG; 4.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)25 ℃誘導(dǎo)上清 Supernatant of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced at 25 ℃; 5.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)25 ℃誘導(dǎo)沉淀 Sediment of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced at 25 ℃; 6.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)30 ℃誘導(dǎo)上清 Supernatant of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced at 30 ℃; 7.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)30 ℃誘導(dǎo)沉淀 Sediment of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced at 30 ℃; 8.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)37 ℃誘導(dǎo)上清 Supernatant of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced at 37 ℃; 9.pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)37 ℃誘導(dǎo)沉淀 Sediment of pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) was induced at 37 ℃

圖12 融合蛋白pET28a-CmFeSOD-BL21(DE3)誘導(dǎo)溫度優(yōu)化及可溶性檢測
Fig.12 Optimal temperature of fusion proteinpET28a-CmFeSOD-BL21(DE3) induced atcondition of differed temperatures andsolubility detection of protein

3 討 論

植物遭受病原菌侵染后會(huì)誘發(fā)活性氧的迸發(fā)，被認(rèn)為是植物抵抗病原菌侵染的特征反應(yīng)[17]，SOD作為植物體內(nèi)的活性氧清除劑，能催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，解除其毒害作用，保護(hù)植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能[18]，從而使得SOD與植物的抗病性緊密聯(lián)系在一起。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從板栗中克隆CmFeSOD基因的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列與其他植物同源物均具有很高的同源性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，板栗SOD蛋白具有Sod_Fe_C、Sod_Fe_N結(jié)構(gòu)域和鐵錳超氧化物歧化酶信號(hào)位點(diǎn)，表明板栗SOD屬于FeSOD類型。已有報(bào)道表明銀杏[19]、菘藍(lán)[20]和小麥[21]等多種植物也具有同一類型的FeSOD。CmFeSOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)以擬南芥AtSOD蛋白(pdb，4c7u.1)[22]為模板構(gòu)建獲得，表明CmFeSOD可能與AtSOD具有相似的功能。進(jìn)化樹分析顯示，板栗與喬木樹種中的核桃親緣關(guān)系最近，與草本植物中的葡萄親緣關(guān)系最近，與單子葉植物中的小果野芭蕉親緣關(guān)系最近。

本研究在3 種溫度(25 ℃、30 ℃和37 ℃)條件下誘導(dǎo)獲得的目的蛋白均以包涵體形式存在，該結(jié)果與小麥FeSOD基因[21]的重組表達(dá)情況相同，但其使用的原核表達(dá)載體為pET-DuetI；韋澤秀等[23]使用相同的pET28a載體表達(dá)青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHK.f.)CML19基因獲得的重組蛋白也主要以包涵體形式存在。而高健等[24]使用pQE-30原核表達(dá)載體表達(dá)特異種質(zhì)煙草(HZHN)FeSOD基因能獲得活性為402 U/g的可溶性蛋白；汪瀅等[25]進(jìn)行發(fā)菜SOD基因的原核表達(dá)也能獲得較多的可溶性目的蛋白，其使用的是pET32a載體?？梢姡煌脑吮磉_(dá)載體，對(duì)目的蛋白可溶性的表達(dá)具有一定程度的影響。

4 結(jié) 論

本研究首次從板栗中獲得1個(gè)長度為705 bpCmFeSOD基因的cDNA序列，其編碼蛋白具有FeSOD超家族特有的序列特征和保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，在進(jìn)化上十分保守。通過原核表達(dá)在30 ℃，添加0.4 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)3 h獲得的CmFeSOD蛋白表達(dá)量最高，分子質(zhì)量約為29 ku，其主要以包涵體的形式存在。