葡萄HAK基因家族的鑒定與表達(dá)分析

馬麗娟，馬 鈺，何紅紅，梁國平，萬 鵬，陳佰鴻，毛 娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070)

葡萄(VitisviniferaL.)作為世界四大水果之一，食用價(jià)值高，而且營養(yǎng)豐富。近年來，葡萄種植區(qū)域逐漸向南、北擴(kuò)增種植[1]。西北地區(qū)由于具有適宜葡萄生長的生態(tài)環(huán)境，已經(jīng)發(fā)展成為國內(nèi)重要的葡萄與葡萄酒產(chǎn)區(qū)。然而，由于西北地區(qū)的土壤和天氣狀況，如：干旱、低溫凍害頻繁發(fā)生，土壤鹽漬化程度高，使得西北地區(qū)貧瘠的土壤和脆弱的生態(tài)環(huán)境成為制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(high affinity K+transporter，HAK)是高親和K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體基因KUP/HAK/KT家族中的一員，HAK轉(zhuǎn)運(yùn)家族也稱為KUP或KT轉(zhuǎn)運(yùn)家族[2]，是植物鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體4個(gè)家族(KUP/HAK/KT家族、Trk/HKT家族、KEA家族、CHX家族)中成員最多的一個(gè)家族，為H+/K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體，主要介導(dǎo)植物中K+等元素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和根部生長素的運(yùn)輸[3-5]。研究表明，該家族基因的表達(dá)受植物自身生長發(fā)育，調(diào)節(jié)因子和環(huán)境刺激等因素的調(diào)控，參與植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)機(jī)制[6]。其中，HAK基因的表達(dá)能使植物在低鉀及鹽脅迫條件下提高對K+的吸收能力，維持正常的K+濃度和生理功能，保持低Na+/K+比，從而提高植物的耐鹽性[7]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下AtKUP2、AtKUP3、AtKUP6、AtKUP12的表達(dá)存在不同程度的上調(diào)[8]。HAK轉(zhuǎn)運(yùn)家族在旱脅迫方面也有重要的作用，在玉米中，存在多種假定的順式作用元件，其中水分脅迫順式元件ACGTATERD1在玉米的HAK基因家族的27個(gè)成員中都存在[9]。另外，還有元件ABRERATCAL、Ca2+-responsive element廣泛存在于玉米HAK基因家族的23個(gè)成員中[10]。除此之外，還有其他非生物脅迫反應(yīng)元件存在于大多數(shù)的成員中，ABRELATERD1、PRECONSCRHSP70A和SEBFCONSSTPR10A作用于脫水反應(yīng)[11]。目前，對HAK基因家族的研究主要在擬南芥、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)[10,12-14]中。

葡萄(VitisviniferaL.)是繼擬南芥、水稻和楊樹后完成全基因測序的第4種開花植物，其基因組大約是擬南芥基因組的3～4倍(約為500Mb)。目前，葡萄抗逆相關(guān)基因的研究已經(jīng)比較廣泛，但對于葡萄中的HAK基因家族成員抗逆性研究也未見報(bào)道，因此，本研究旨在利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行葡萄HAK基因家族的分離與功能鑒定，進(jìn)而為葡萄抗逆栽培調(diào)控與遺傳改良等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為葡萄‘紅地球’(VitisviniferaL.‘Red Globe’)試管苗，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。將紅地球葡萄試管苗莖段接種于GS固體培養(yǎng)基上，置于LED白光(WLED 424～724 nm，459 nm)的人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為28 ℃，220 μmol·m-2·s-1光照16 h；23 ℃暗培養(yǎng)8 h。

1.2 試管苗RNA提取

待葡萄試管苗生長至30 d后，選取長勢一致的試管苗，分別用400 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% PEG處理 6 h，每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)，以蒸餾水處理為對照。處理后取葉片于液氮中速凍，然后置于 -80 ℃冰箱中保存，并用CTAB法提取總RNA。

1.3 葡萄HAK基因家族成員的獲得

下載玉米、水稻和擬南芥HAK基因的CDS序列，在葡萄基因組庫的(http://www.genoscope.cns)Blast-Search中，檢索篩選得到的葡萄HAK基因候選成員。運(yùn)用DNAMAN軟件，將候選的CDS序列進(jìn)行比對分析，篩除相似度 >98%的基因，最后得到無重復(fù)區(qū)段的葡萄HAK基因家族成員的序列。

1.4 葡萄HAK蛋白理化性質(zhì)的分析

運(yùn)用ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)獲得葡萄HAK基因家族成員的分子質(zhì)量大小、理論等電點(diǎn)、編碼蛋白氨基酸數(shù)目等基本理化性質(zhì)；在作圖軟件中進(jìn)行染色體定位，通過在線軟件SOPMA(NPS@: SOPMA secondary structure prediction)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；通過PSORT(http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/ form.Html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測。

1.5 葡萄HAK基因結(jié)構(gòu)和順式作用元件分析

通過GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對葡萄HAK基因家族成員外顯子的長度和結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[15]；在NCBI中獲得每個(gè)成員的啟動(dòng)子上游2 kb區(qū)域的序列，使用PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)在線軟件[16]進(jìn)行順式作用元件分析；采用TMHMM在線軟件[17](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析。

1.6 葡萄HAK基因多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

運(yùn)用ClustalX 2.1[18]和 MEGE 5.0[19]，使用鄰近法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，用DNAMAN對VvHAKs進(jìn)行多序列比對。

1.7 葡萄HAK基因芯片表達(dá)譜分析

從NCBI提供的GEO數(shù)據(jù)庫中下載葡萄RNASeq數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為GSE31594、GSE31662、GSE31675和GSE31677，數(shù)據(jù)分別是鹽、干旱、低溫、高溫、ABA和水分脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)。用葡萄LBD核酸序列為探針檢索出序列相同的Affymetrix GeneChip 16 K基因ID，然后提取葡萄LBD基因在各種非生物脅迫下的RNASeq數(shù)據(jù)，通過Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，最后用HemI制作電子表達(dá)熱圖(heatmap)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)表達(dá)分析

應(yīng)用Bio-Rad iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR儀對VvHAKs進(jìn)行逆境表達(dá)分析，使用SYBR GreenⅠ(TaKaRa)試劑盒，以葡萄管家基因UBI為內(nèi)參基因[20]。擴(kuò)增體系含1 μL cDNA，上下游引物各0.8 μL(表1)，10.4 μL反應(yīng) SYBR MIX， 7 μL ddH2O，總體系20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃下退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線。基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算[21]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，用Excel 2013軟件和SPSS version 22.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄HAK基因家族的理化性質(zhì)和染色體定位

染色體定位分析表明(圖1)：VvHAKs的18個(gè)家族成員中，有17個(gè)成員分別分布于9條不同的染色體上，VvHAK09的位置未知。其中1號(hào)染色體上有5個(gè)成員，7號(hào)染色體上有4個(gè)成員，14號(hào)染色體上有2個(gè)成員，2、6、12、13、17和19號(hào)染色體上各有1個(gè)成員。除了7號(hào)染色體上的家族成員分布較為集中外，其余成員分布的較為分散，未表現(xiàn)出集中性。位置結(jié)構(gòu)信息表明(表2)，VvHAKs中CDS序列最短的是VvHAK07，為 1 845 bp，最長的是VvHAK04，為2 400 bp，大多數(shù)成員的CDS序列長度為2 000～2 500 bp；葡萄HAK基因家族編碼氨基酸個(gè)數(shù)為614～800；葡萄HAK基因家族中，VvHAK02等電點(diǎn)最小，為7.35，VvHAK18等電點(diǎn)最大，為9.03，大多數(shù)成員的等電點(diǎn)主要集中在8～9之間，表明葡萄HAK基因家族的蛋白質(zhì)呈弱堿性，外顯子數(shù)目為7～12個(gè)。

2.2 葡萄HAK基因家族的結(jié)構(gòu)分析

葡萄HAK基因家族的外顯子個(gè)數(shù)為7～12，其中，VvHAK04、VvHAK08、VvHAK15、VvHAK13、VvHAK14、VvHAK16和VvHAK18均含有9個(gè)外顯子；VvHAK02、VvHAK06、VvHAK10、VvHAK11和VvHAK12均含有10個(gè)外顯子；VvHAK01、VvHAK05和VvHAK09均含有11個(gè)外顯子；VvHAK03含有12個(gè)外顯子；VvHAK07含有7個(gè)外顯子；VvHAK17含有8個(gè)外顯子。將葡萄HAK基因家族的18個(gè)成員進(jìn)行聚類并結(jié)合外顯子結(jié)構(gòu)分析表明(圖2)，進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)近與外顯子結(jié)構(gòu)分布有關(guān)，聚類關(guān)系近，外顯子數(shù)量相近，如：VvHAK05、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16和VvHAK18，可推測具有相似編碼區(qū)結(jié)構(gòu)的成員功能上有一定的相似性。

表1 葡萄HAK基因家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 The primers for qRT-PCR analysis of VvHAKs gene expression

1～18. VvHAK01-VvHAK18

表2 葡萄HAK基因的位置結(jié)構(gòu)信息Table 2 Position structure informations of VvHAKs

圖2 葡萄HAK基因家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structures of VvHAKs

圖3 葡萄HAK多序列比對Fig.3 The multiple sequence alignment of VvHAKs

2.3 葡萄HAK基因家族的多序列比對與進(jìn)化分析

VvHAK07、VvHAK13和VvHAK17這3個(gè)基因家族成員之間區(qū)段的保守性較低，其余的15個(gè)基因家族成員之間區(qū)段的保守性較高且在N端附近發(fā)現(xiàn)有典型的鉀離子KT/KUP/HAK的保守區(qū)域GVVYGDLGTSPLY(圖3)。系統(tǒng)進(jìn)化樹可將HAK基因家族(圖4)分為7個(gè)亞族，其中VvHAKs成員分布為：第1亞族中有4個(gè)成員，包含VvHAK02、VvHAK06、VvHAK08和VvHAK09；第2亞族中5個(gè)成員，包含VvHAK01、VvHAK03、VvHAK04、VvHAK11和VvHAK13；第3亞族中有3個(gè)成員，分別為VvHAK01、VvHAK11和VvHAK13；第4亞族中只有VvHAK10；第5亞族中僅有VvHAK17；第6亞族中有2個(gè)成員，為VvHAK07和VvHAK12；第7亞族中有5個(gè)成員，包括VvHAK05、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16和VvHAK18。

圖4 擬南芥、玉米、水稻和葡萄HAK基因進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree using the HAK amino acid sequence from grape,Arabidopsis,rice and maize

2.4 葡萄HAK基因家族編碼蛋白Motif分析

Motif分析HAK基因家族的18個(gè)成員，得出有15個(gè)基序(圖5)。Motif分析表明：VvHAKs中GroupⅠ的5個(gè)成員，VvHAK14、VvHAK15和VvHAK18有15個(gè)基序，VvHAK05不含Motif 15，VvHAK07不含Motif 11和Motif 12，整個(gè)GroupⅠ在 N端的保守性很高，結(jié)合聚類分析和外顯子分析結(jié)果可推測，這5個(gè)成員在功能上具有相似性；GroupⅡ的9個(gè)成員，除VvHAK13外，其余8個(gè)成員在N端具有較高的保守性，具有較多相似的基序，推測這類亞組的成員執(zhí)行功能相似；Group Ⅲ的VvHAK10和VvHAK12具有14個(gè)基序，沒有Motif 15，VvHAK07不具有Motif 2、Motif 5、Motif 7和Motif 15，N端的保守性不高，與多序列比對結(jié)果一致。Group Ⅳ的2個(gè)成員，其中VvHAK07不具有Motif 7和Motif 15。由此可以得出：Motif 15為GroupⅠ中家族成員特有的基序，基序所表達(dá)的保守程度同多序列比對分析得出的結(jié)論一致。

2.5 葡萄HAK基因家族的二級結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位

葡萄HAK基因家族編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主，成員跨膜區(qū)域數(shù)為9～14個(gè)(表3)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明(表4)，葡萄HAK基因家族的18個(gè)成員在細(xì)胞質(zhì)膜上均有表達(dá)，且表達(dá)量較高，這與其主要作為鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子參與K+吸收的功能是一致的；在細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中幾乎沒有表達(dá)。但是VvHAK06在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量高于在細(xì)胞質(zhì)膜上的表達(dá)，推測此蛋白可能位于細(xì)胞質(zhì)上；VvHAK08和VvHAK16這2個(gè)成員在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上都有表達(dá)，推測這2個(gè)家族成員的蛋白在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜均有定位，剩余的15個(gè)VvHAKs成員則主要在質(zhì)膜上表達(dá)。

蛋白Proteinα-螺旋/%Alpha helixβ-轉(zhuǎn)角/%Beta turn不規(guī)則卷曲/%Random coil跨膜區(qū)域數(shù)目Numbers of transmembrane regionsVvHAK0144.719.5223.4111VvHAK0235.519.7929.5013VvHAK0333.899.4427.5912VvHAK0436.508.8827.2514VvHAK0542.119.7623.5311VvHAK0637.799.3826.9012VvHAK0740.239.1226.389VvHAK0840.149.6626.9413VvHAK0937.929.8927.4112VvHAK1036.429.0126.3414VvHAK1136.399.5925.9511VvHAK1243.918.3425.8512VvHAK1343.457.9523.8611VvHAK1436.819.6225.0012VvHAK1536.759.3225.7012VvHAK1637.569.7727.6312VvHAK1740.1911.9925.5510VvHAK1837.1910.2225.3412

表4 葡萄HAK基因亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 4 Subcellular location prediction of VvHAKs

注：- 表示無表達(dá)；Cyto代表細(xì)胞質(zhì)；E.R代表內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Chol代表葉綠體；Mito代表線粒體；Vacu代表液泡膜；Plas代表細(xì)胞質(zhì)膜；Nucl代表細(xì)胞核；Extr代表細(xì)胞基質(zhì)；Pero代表過氧化物酶體；表內(nèi)的數(shù)值代表準(zhǔn)確率，分值越高，代表預(yù)測的準(zhǔn)確性越高。

Note:- represents no expression; Cyto represents cytoplasm; E.R represents endoplasmic reticulum; Chol represents chloroplast; Mito represents mitochondria; Vacu represents tonoplast; Plas represents membrane; Nucl represents nucleus; Extr cells represent the matrix; Pero represents peroxisome; numerical representation form accuracy rate,the higher the score,the higher the accuracy of predicted.

2.6 順式作用元件分析

對葡萄HAK基因家族的順式作用元件進(jìn)行分析表明(表5)，VvHAKs中GroupⅠ的5個(gè)成員VvHAK05、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16和VvHAK18均存在ABA響應(yīng)元件，其中VvHAK16還存在DRE和LTRE元件，說明葡萄HAK GroupⅠ的功能可能與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。VvHAKs中GroupⅡ的9個(gè)成員，分別為VvHAK01、VvHAK02、VvHAK03、VvHAK04、VvHAK06、VvHAK08、VvHAK09、VvHAK11和VvHAK13，它們均含有LTRE元件，與GroupⅡ在植物體內(nèi)參與植物生理活動(dòng)的規(guī)律一致，其中VvHAK04、VvHAK08、VvHAK09、VvHAK11和VvHAK13含有ABA和DRE響應(yīng)元件，說明葡萄HAK基因家族GroupⅡ的功能除了參與植物生理作用外，可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。VvHAKs中GroupⅢ的VvHAK12不存在ABA響應(yīng)元件、DRE和LTRE元件，只與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)；GroupⅣ的VvHAK17中只有ABA響應(yīng)元件，可能參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。葡萄HAK基因上游2 kb區(qū)域所包含的順式作用元件因所屬亞族的不同，使元件表達(dá)具有差異性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有成員上游2 kb區(qū)域均存在MYB和WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，說明VvHAKs的表達(dá)與MYB和WRKY轉(zhuǎn)錄因子作用密切相關(guān)，并且這些順式作用元件可能單個(gè)發(fā)揮作用，也可能共同參與葡萄HAK基因家族的表達(dá)。

2.7 葡萄HAK基因芯片表達(dá)譜分析

對葡萄HAK基因芯片表達(dá)譜進(jìn)行表達(dá)分析(VvHAK11除外)，結(jié)果顯示，葡萄HAK基因家族在受到鹽、干旱、低溫、高溫、ABA及水分脅迫等非生物脅迫時(shí)，基因表達(dá)水平變化顯著(圖6)。VvHAK06在響應(yīng)水分脅迫時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)，而VvHAK17明顯下調(diào)；VvHAK01、VvHAK15和VvHAK18在響應(yīng)高溫脅迫時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)，而VvHAK06則呈現(xiàn)先下調(diào)再上調(diào)的趨勢；VvHAK09和VvHAK13在響應(yīng)高溫脅迫時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)的趨勢；VvHAK04、VvHAK06、VvHAK07、VvHAK08和VvHAK12在響應(yīng)鹽、干旱、高溫脅迫下的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢。VvHAK17在響應(yīng)鹽、干旱脅迫時(shí)的表達(dá)量呈現(xiàn)先下調(diào)再上調(diào)的趨勢。VvHAK10在響應(yīng)低溫脅迫時(shí)表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢，VvHAK15和VvHAK18在響應(yīng)干旱和低溫脅迫處理后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。葡萄HAK基因家族對ABA脅迫的響應(yīng)不明顯。

表5 葡萄HAK基因順式作用元件的分布Table 5 Distribution patterns of VvHAKs cis-acting elements

圖中用紅色、白色、藍(lán)色代表基因表達(dá)水平。藍(lán)色表示基因表達(dá)弱，紅色表示基因表達(dá)強(qiáng) Red,white and blue are used to represent gene expression levels.Blue indicates weak gene expression,red indicates strong gene expression

圖6 葡萄HAK基因表達(dá)譜
Fig.6 Expression profile ofHAKgenes in grape

2.8 葡萄HAK基因家族成員在非生物脅迫下的表達(dá)分析

葡萄HAK基因家族在ABA、PEG和NaCl 3種脅迫下的表達(dá)量具較顯著差異(圖7)。VvHAK01、VvHAK05在50 μmol·L-1ABA處理6 h后，葉片表達(dá)量明顯下調(diào)，其余均為上調(diào)；其中，VvHAK04、VvHAK06、VvHAK08、VvHAK09、VvHAK10、VvHAK13和VvHAK15同時(shí)在50 μmol·L-1ABA 和10% PEG處理 6 h后上調(diào)；VvHAK06、VvHAK07、VvHAK09、VvHAK10、VvHAK11和VvHAK13在50 μmol·L-1ABA 和400 mmol·L-1NaCl處理6 h后上調(diào)。VvHAK01、VvHAK02、VvHAK03、VvHAK04、VvHAK05、VvHAK08、VvHAK14、VvHAK15、VvHAK16、VvHAK17和VvHAK18在400 mmol·L-1NaCl處理6 h后葉片表達(dá)量明顯下調(diào)，說明6 h內(nèi)，鹽脅迫在一定程度上抑制基因的表達(dá)。VvHAK03、VvHAK05、VvHAK07、VvHAK11、VvHAK14在10 % PEG處理6 h后葉片表達(dá)量下調(diào)，可能與其不存在順式作用元件DRE有關(guān)，同時(shí)VvHAK03、VvHAK05和VvHAK14在400 mmol·L-1NaCl處理6 h后，葉片表達(dá)量明顯下調(diào)，說明400 mmol·L-1NaCl抑制VvHAK03、VvHAK05和VvHAK14基因的表達(dá)。

3 討 論

植物在發(fā)育過程中進(jìn)化出一套保護(hù)機(jī)制，以此來應(yīng)對干旱、高鹽、溫度和氧化等逆境脅迫。在這些不利因素下，植物可以通過啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，形成具有不同功能的蛋白來保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的各種新陳代謝反應(yīng)，進(jìn)而維持植物體結(jié)構(gòu)與功能的完整性[22]。

HAK轉(zhuǎn)運(yùn)體家族首次發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中[23]，現(xiàn)已在植物中發(fā)現(xiàn)4個(gè)主要的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族，其中KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運(yùn)子家族是最大的基因家族[3]。本研究共得到18個(gè)葡萄HAK家族成員，Motif 分析將葡萄HAK基因家族分為4個(gè)亞族，VvHAKs成員主要以GroupⅠ和GroupⅡ?yàn)橹?，GroupⅢ和GroupⅣ中的成員相對較少。系統(tǒng)發(fā)育樹中葡萄HAK的家族成員與擬南芥HAK基因家族成員有較高的同源性，且發(fā)現(xiàn)同一物種間的成員在進(jìn)化樹中分布較為集中，玉米HAK和水稻HAK這兩個(gè)家族成員之間同源性較高。

已有研究表明：結(jié)構(gòu)上存在數(shù)目不等的跨膜域，并且N端具有相對保守區(qū)域，是KUP/HAK/KT基因家族的共同特征；多序列比對發(fā)現(xiàn)VvHAKs的大多數(shù)成員在N端有相對保守區(qū)域，而且二級蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)整個(gè)葡萄HAK家族均有至少9個(gè)跨膜區(qū)域，這與玉米基因家族二級結(jié)構(gòu)分析類似[10]，VvHAKs外顯子數(shù)目和結(jié)構(gòu)在不同亞族間差異很大，但同一亞族中編碼區(qū)結(jié)構(gòu)類似，這一規(guī)律與大豆HAK家族中的類似[24]。染色體定位表明，除了第7條染色體上的4個(gè)成員分布比較集中以外，其余8條染色體上的成員的分布相對分散，整體未表現(xiàn)出集中性。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，VvHAKs主要是在質(zhì)膜上表達(dá)，這與其作為鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能是一致的[24]，且這個(gè)結(jié)果與林煙草中HAK基因的亞細(xì)胞定位研究結(jié)果相同[25]。在玉米和水稻中的多數(shù)成員中存在ABRE作用元件，這些作用元件可能會(huì)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用，而ABA在生物體內(nèi)最主要的功能是作為激素參與植物對外界脅迫的適應(yīng)。在植物對非生物脅迫應(yīng)答中，脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)存在ABA依賴途徑，在這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域有一些保守的ABA反應(yīng)元件，ABRE作用元件對一些受ABA誘導(dǎo)的抗逆基因的表達(dá)起調(diào)控作用，對基因響應(yīng)ABA誘導(dǎo)至關(guān)重要[26]。

芯片表達(dá)譜分析表明，30 ℃高溫條件下，VvHAK01、VvHAK15和VvHAK18的表達(dá)量最高，表明其對葡萄漿果成熟具有正調(diào)控作用；VvHAK06在響應(yīng)水分、高鹽、干旱及高溫脅迫時(shí)，在葡萄莖尖和葉片組織中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢。定量分析表明，在不同脅迫下葡萄HAK基因家族成員在葉片中的表達(dá)程度不同。VvHAK13在50 μmol·L-1ABA、10% PEG處理6 h后，葉片表達(dá)量顯著上調(diào)；VvHAK05在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl、10 % PEG處理6 h后，葉片表達(dá)量顯著下調(diào)；與芯片表達(dá)譜分析一致。VvHAK07和VvHAK09在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl處理6 h后顯著上調(diào)；VvHAK09的表達(dá)與芯片表達(dá)譜分析一致。VvHAK01、VvHAK05在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl處理6 h后顯著下調(diào)；與芯片表達(dá)譜分析一致。VvHAK03、VvHAK05和VvHAK14在 400 mmol·L-1NaCl、10 % PEG處理6 h后顯著下調(diào)；VvHAK05和VvHAK14與芯片表達(dá)譜分析一致。擬南芥鹽脅迫后AtHAK06和AtHAK11的表達(dá)顯著增加，而AtKUP02的轉(zhuǎn)錄則顯著下降，在低鹽的脅迫下AtHAK05和ThHAK05都受到Na+的抑制[27]，HvHAK1和NrHAK1在100 mmol·L-1NaCl處理后表達(dá)上調(diào)，鹽脅迫對SeHAK1轉(zhuǎn)錄水平的影響因鹽角草的發(fā)育時(shí)期以及鹽脅迫處理時(shí)間和濃度的不同而異[28]。葡萄HAK基因家族中的11個(gè)成員在高鹽脅迫后，葉片的表達(dá)量下調(diào)，有可能是HAK基因家族在葡萄葉片中表達(dá)較少或者是在生長期表達(dá)量低，也可能是400 mmol·L-1NaCl濃度超過葡萄HAK基因家族耐鹽程度。植物生長過程中基因表達(dá)水平的變化實(shí)質(zhì)上是受到植物激素的調(diào)節(jié)。在實(shí)時(shí)熒光定量分析中葡萄HAK基因家族成員的表達(dá)均受ABA調(diào)節(jié)，表明ABA對HAK/KUP/KT基因的表達(dá)可能具有調(diào)控作用。

圖7 葡萄HAK基因家族在不同處理下的相對表達(dá)水平Fig.7 Relative expression of VvHAKs under different treatments