人CD8+T細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

韓鵬勇，塔 娜，寶魯日，于海泉

(內(nèi)蒙古大學(xué)，省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010070)

免疫系統(tǒng)在病毒感染、腫瘤免疫應(yīng)答等方面有重要作用。Dunn等[3]發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤存在免疫編輯現(xiàn)象，而免疫逃逸是所有癌癥類型的主要特征之一，腫瘤細(xì)胞通過招募正常免疫細(xì)胞形成腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Reiser等[4]發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)中的na?ve CD8+T細(xì)胞在急性感染時(shí)，分化成效應(yīng)細(xì)胞，在病原體清除后以記憶細(xì)胞形式長(zhǎng)期儲(chǔ)存。在慢性感染或腫瘤中，CD8+T細(xì)胞變?yōu)椤肮δ墚惓顟B(tài)”的表型。但腫瘤微環(huán)境影響腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞，使其喪失識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞的能力，具體作用機(jī)制有待深入研究?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞分裂、分化、癌變、死亡等生理過程中起關(guān)鍵作用[5]。Corces 等[6]建立一種靠轉(zhuǎn)座酶插入到染色體開放區(qū)域結(jié)合高通量測(cè)序的 ATAC-seq 技術(shù)，轉(zhuǎn)錄因子在該開放區(qū)域的不同位點(diǎn)結(jié)合控制下游基因的表達(dá)和關(guān)閉[8]，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和染色體開放區(qū)域數(shù)據(jù)可以繪制特定細(xì)胞類型的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[9]。通過分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)鑒定在特定生物過程中的基因、關(guān)鍵調(diào)控因子和局部亞網(wǎng)絡(luò)[10]，從而揭示癌癥特性及癌癥病人愈后相關(guān)的分子機(jī)制和信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11]。

Cayuela等[2]發(fā)現(xiàn)黑色素瘤占據(jù)所有皮膚癌致死率的80%，是危害人類健康的主要癌癥之一,目前在其免疫治療中,免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗PD1和抗CTLA4)通過阻斷T細(xì)胞表面抑制性受體而擴(kuò)增免疫應(yīng)答，引起腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。本試驗(yàn)通過已有ATAC-seq技術(shù)研究人黑色素腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞數(shù)據(jù)，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及細(xì)胞表面受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行比較分析，為系統(tǒng)鑒定復(fù)雜生理過程中的基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ATAC-seq數(shù)據(jù)

來自黑色素瘤病人血液中的 na?ve CD8+T(HN)、效應(yīng)記憶CD8+T(HEM)、中央記憶細(xì)胞CD8+T(HCM)，黑色素瘤浸潤(rùn)性功能異常CD8+T[(PD1)數(shù)據(jù)ID為GSE89308]，來自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[12]。

1.2 注釋峰文件

通過HOMER軟件注釋峰文件，得到注釋的基因，選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2 kb作為匹配序列[8,13]。

1.3 制作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

采用MEME軟件的FIMO(Find individual motif occurrences)模塊匹配DNA結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄因子，將峰的匹配序列與MEME的結(jié)合基序數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(P<1×10-4)[14]。通過Linux腳本程序鑒定轉(zhuǎn)錄因子與其調(diào)控的基因，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞表面受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過編程尋找每種細(xì)胞特異的基因、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞表面受體。

1.4 網(wǎng)絡(luò)可視化及基因通路富集分析

采用Cytoscape對(duì)差異調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析[15]，通過Enrichr對(duì)差異基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與比較

通過對(duì)3種正常CD8+T類型HCM、 HEM、 HN 和功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)的峰文件用HOMER軟件注釋，選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上下2 kb的bed文件，用FIMO 和Bedtools軟件生成的fasta文件進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建每種細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示HCM 和HEM注釋的基因14 084 個(gè)， HN注釋的基因10 397個(gè)，PD1注釋的基因14 015個(gè)。這 4 種細(xì)胞含有10 298個(gè)相同基因，如圖1所示，與PD1處理細(xì)胞相比，HEM和HCM含有69個(gè)特異的基因，HN有99個(gè)，功能異常CD8+T細(xì)胞、HEM和HCM比HN細(xì)胞多3 717個(gè)基因(圖1)。

圖1 HCM、HEM、HN、PD1細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較Fig.1 Comparison of gene regulatory network in HCM，HEM,HN,PD1

每種細(xì)胞特異基因通過Enrichr網(wǎng)站信號(hào)通路富集分析(表1)，HN 特異基因富集的信號(hào)通路有凋亡與組織穩(wěn)態(tài)相關(guān)DNA 片段化通路、顆粒酶 A介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、蛋白水解、 Notch信號(hào)通路、GATA3參與活化 Th2 細(xì)胞因子的活化通路等；HEM和HCM特異基因富集的信號(hào)通路有Ras通路、Erk PI3K通路、整合素信號(hào)通路等。功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)特異的信號(hào)通路有BRCA1、BRCA2和ATR介導(dǎo)的癌癥易感性通路、端粒酶RNAhTERC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路，雌激素響應(yīng)蛋白Efp控制的細(xì)胞周期等信號(hào)通路。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與比較分析

以3 種正常CD8+T細(xì)胞亞型和功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)分別構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)并進(jìn)行比較分析，HCM和HEM含有475個(gè)相同的轉(zhuǎn)錄因子，HN含有 365 個(gè)，而功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)含有 474 個(gè)(圖2)。與功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)相比 ，3 種正常CD8+T細(xì)胞亞型中GBEB2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)關(guān)閉，功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)、HCM和HEM細(xì)胞比HN細(xì)胞多 58 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

對(duì)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和基因潛在的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)HEM和HCM細(xì)胞中GMEB2轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控KCNQ2和RALGDS，HN細(xì)胞GMEB2轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控KCNQ2、RALGDS和TBCD。與HN細(xì)胞相比，功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)增加的ZFX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控51個(gè)基因，3 種正常CD8+T細(xì)胞中GMEB2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控KCNQ2和RALGDSPD1，而功能異常細(xì)胞中隨著GMEB2轉(zhuǎn)錄因子的丟失，其調(diào)控的基因也丟失，而ZFX轉(zhuǎn)錄因子和其調(diào)控的相應(yīng)基因同時(shí)被激活。

表1 3 種正常CD8+ T亞型和腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞差異基因信號(hào)通路富集分析Table 1 Comparison of differential gene pathway enrichments in 3 CD+8 subtypes and tumor infiltrating CD8+T cells

圖2 HCM、HEM、HN、PD1細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較Fig.2 Comparison of gene regulatory network in HCM,HEM,HN,PD1

2.3 細(xì)胞表面受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較分析

從每種細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提取細(xì)胞表面受體，制作相應(yīng)細(xì)胞的表面受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行比較分析(表2)，發(fā)現(xiàn)HCM和HEM含有細(xì)胞表面受體493個(gè)，HN有377個(gè)，功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)有492個(gè)。與功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)進(jìn)行對(duì)比，HCM、HEM存在特異的細(xì)胞表面受體CD7，HN存在CD7和P4HB。與HCM和HEM相比，PD1沒有特殊的細(xì)胞表面受體；與HN相比，HCM、HEM和PD1細(xì)胞增加117個(gè)細(xì)胞表面受體。

增加的117個(gè)細(xì)胞表面受體中，HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-F、HLA-F-AS1、HLA-G為MHCI相關(guān)基因，MMP15、MMP2、MMP25為基質(zhì)金屬蛋白酶基因，參與炎癥反應(yīng)，F(xiàn)as誘導(dǎo)凋亡，F(xiàn)as配體參與抗腫瘤效應(yīng)。對(duì)這些特異的受體進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，如表3所示，富集的有TCR激活、IL2介導(dǎo)T細(xì)胞激活、IL4信號(hào)通路、抗原處理與呈遞信號(hào)通路等，表明HN細(xì)胞在受到抗原刺激后，激活T細(xì)胞識(shí)別和攻擊腫瘤的能力。

圖3 HEM、HCM、HN、PD1細(xì)胞差異轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Differential regulatory networks in HEM,HCM,HN and PD1

細(xì)胞類型Cell type和HN相比增加的表面受體Increased cellular receptors in PD1,HEM,HCM in contrast to HNPD1、HEM、HCMACTN2、ADAM17、ADIPOQ、AGGF1、BGN、BST2、C1QBP、C3AR1、C9、CALM3、CALR、CCR10、CD151、CD163、CD1D、CD3G、CD4、CD63、CD70、CD8B、CHID1、CLEC2D、CLU、COL1A1、CP、CTGF、CXCL5、DAG1、DLL4、DSC1、DSCAML1、EMC7、EMILIN1、EPHB1、ESF1、F11R、F2R、FAS、FCGR3A、GCG、GP9、GUCY2D、HGFAC、HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-F、HLA-F-AS1、HLA-G、ICAM1、ICAM3、IFITM3、IGF2、IGFBP4、IGFBP6、IL12A、IL12A-AS1、IL15RA、IL1R1、IL1RL1、IL2RA、IL2RG、IL6、IL6ST、INHBC、ITGA1、ITGA5、ITGAD、ITGB3、ITGB7、ITIH2、ITM2B、JAG2、KIDINS220、LAMB1、LGALS3BP、LMAN2、LPA、LSR、MASP2、MERTK、MET、MFGE8、MMP15、MMP2、MMP25、MS4A1、OSTC、PDGFRB、PILRA、PLXNA1、PPIA、PPT1、PRAF2、PRSS3、PTGDR、PT-PRF、S100A4、S100B、SCARF1、SEMA4C、SFN、SLC30A5、SLC4A2、SLC7A11、SLC9A1、SORT1、SPINT2、ST14、TLR4、TMEM256-PLSCR3、TMEM9、TNFRSF4、TNFSF4、VASN、VCAN-AS1、YIF1A

表3 PD1、HEM、HCM比HN細(xì)胞增加細(xì)胞表面受體富集的信號(hào)通路Table 3 Cellular surface receptors pathway enrichment in PD，HEM，HCM contrast to HN

3 討論與結(jié)論

3.1 4 種細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較分析

對(duì) 4 種細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)比較分析發(fā)現(xiàn)，每種細(xì)胞有特異的基因，通過對(duì)特異基因進(jìn)行基因通路富集分析發(fā)現(xiàn)，HN 特異的信號(hào)通路有凋亡與組織穩(wěn)態(tài)DNA片段化通路，顆粒酶 A介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，蛋白水解和 Notch通路，GATA3 參與活化 Th2 細(xì)胞因子活化通路，Calcineurin角質(zhì)細(xì)胞分化通路。HEM和HCM基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)類似，存在特異的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有Ras通路，Erk and PI-3k激酶通路，整合素信號(hào)通路，血管內(nèi)皮離子通道等。功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)特異的信號(hào)通路有BRCA1、BRCA2 和ATR介導(dǎo)的癌癥敏感性通路，端粒酶RNA成份hTERC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路，AKAP95在有絲分裂和染色體動(dòng)力學(xué)相關(guān)作用通路， PI3K參與的細(xì)胞周期通路，雌激素響應(yīng)蛋白Efp控制的細(xì)胞周期和細(xì)胞周期素等通路。研究發(fā)現(xiàn)3 種正常CD8+T細(xì)胞亞型特異基因富集的信號(hào)通路有Ras等正常CD8+T細(xì)胞功能相應(yīng)通路，而功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)特異表達(dá)的基因參與細(xì)胞周期、端粒酶等相關(guān)信號(hào)通路。

3.2 4 種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

本研究通過對(duì) 4 種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，和功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)相比，na?ve CD8+T細(xì)胞(HN)增加58個(gè)轉(zhuǎn)錄因子；和HN、HEM、HCM 3種正常CD8+T細(xì)胞亞型相比，功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)丟失轉(zhuǎn)錄因子 GMEB2。在HEM 和HCM細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，GMEB2轉(zhuǎn)錄因子分別調(diào)控KCNQ2和RALGDS，在HN細(xì)胞中GMEB2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控KCNQ2、RALGDS和TBCD。Xiong[25]和Johnson 等[26]發(fā)現(xiàn)KCNQ2和RALGDS參與炎癥反應(yīng)，TBCD參與禽H5N1等病毒感染[24]。PD1細(xì)胞比HN細(xì)胞增加的ZFX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控1 714個(gè)基因。表明丟失的轉(zhuǎn)錄因子和特異的基因之間存在相互調(diào)控關(guān)系。GMEB2是KDWD基因家族成員，基因表達(dá)產(chǎn)物會(huì)和GMEB1相互作用，參與小病毒DNA復(fù)制，如凋亡等糖皮質(zhì)激素基因相關(guān)作用。Kawabe等[25]研究表明IL-12在參與炎癥和免疫應(yīng)答中，通過PI3K/AKt信號(hào)通路上調(diào)GMEB1/2的表達(dá)，會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞抗凋亡作用。Arakawa等[26]發(fā)現(xiàn)GMEB2表達(dá)降低會(huì)減弱T細(xì)胞的抗凋亡功能，該基因是抗炎癥反應(yīng)的重要組成部分。

3.3 4 種細(xì)胞的細(xì)胞表面受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì) 4 種細(xì)胞的細(xì)胞表面受體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，和功能異常CD8+T細(xì)胞(PD1)相比，HCM、HEM細(xì)胞含有特殊的細(xì)胞表面受體CD7，HN細(xì)胞有CD7和P4HB。與HCM、HEM細(xì)胞相比，PD1無特異的細(xì)胞表面受體；與HN細(xì)胞相比，HCM、HEM和PD1細(xì)胞增加117 個(gè)細(xì)胞表面受體，與PD1細(xì)胞相比，HN增加58 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子存在相互調(diào)控關(guān)系，其中ZFX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控51 個(gè)細(xì)胞表面受體。Garin等[27]發(fā)現(xiàn)Galectin-1 (LGALS1) 在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)中表達(dá)選擇性升高，結(jié)合到T細(xì)胞表面受體CD7上。Pace等[28]研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞CD7表達(dá)上調(diào)會(huì)引起LGALS1促T細(xì)胞凋亡信號(hào)。Bi等[29]發(fā)現(xiàn)P4HB是一種結(jié)合Galectin-9 的蛋白。LGALS1和Galectin-9相互作用會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞凋亡。CD7和P4HB的表達(dá)下降，可下調(diào)T細(xì)胞的凋亡水平，可能導(dǎo)致T細(xì)胞增殖異常，向功能異常狀態(tài)轉(zhuǎn)變。Philip等[30]發(fā)現(xiàn)部分PD1高表達(dá)的細(xì)胞CD38和CD101高表達(dá)，CD5低表達(dá)是功能異常T細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記物。Pauken等[31]發(fā)現(xiàn)PD1阻斷治療在一定程度上恢復(fù)部分功能異常T細(xì)胞的表觀變化。王濤等[32]發(fā)現(xiàn)CD7的一個(gè)配體SECTM1在很多腫瘤中都表達(dá)。CD7在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中特異表達(dá)，表達(dá)會(huì)活化T細(xì)胞。表明CD7和P4HB表達(dá)下調(diào)會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞向功能異常狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

抗病育種從分子標(biāo)記輔助育種逐漸發(fā)展到依靠基因組選擇育種[21]，但由于一些性狀的復(fù)雜會(huì)限制分子育種的應(yīng)用?；蚪M選擇育種是基于分子標(biāo)記，編輯造成某些特定性狀的基因[33]。在新西蘭、澳大利亞、英國(guó)采用SNP芯片在牛羊上進(jìn)行輔助育種，存在缺乏合適的表型監(jiān)控、種群小、花費(fèi)高等問題[34]。本文通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)人CD8+T細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄因子GMEB2表達(dá)關(guān)閉，ZFX轉(zhuǎn)錄因子開啟，細(xì)胞表面受體CD7 和P4HB表達(dá)關(guān)閉，關(guān)閉正常CD8+T細(xì)胞參與的信號(hào)通路基因，激活相應(yīng)基因，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N功能異常狀態(tài)。在病毒感染和腫瘤中CD8+T細(xì)胞都發(fā)生功能異常，通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)找到引起功能異常狀態(tài)關(guān)鍵的基因、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞表面受體；通過基因工程等手段提高特異基因的水平，提高動(dòng)物免疫系統(tǒng)CD8+T細(xì)胞在疾病中免疫應(yīng)答，為抗病育種尋找特定基因提供理論基礎(chǔ)及新思路。