川東北地區(qū)CYP2C9基因多態(tài)性對華法林藥代動力學(xué)的影響*

楊思蕓，劉 濤，蘇 強

（四川省南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·個體化藥物治療南充市重點實驗室，四川 南充 637000）

抗凝劑自1950年進(jìn)入臨床使用，其中，維生素K拮抗劑華法林一直是使用最廣泛的口服抗凝劑。華法林能顯著降低房顫患者發(fā)生中風(fēng)的概率，同時也能降低心肌梗死患者的死亡率，但仍有證據(jù)表明其存在治療風(fēng)險[1]。華法林為混合物，包括R-華法林與S-華法林2個對映體，均有藥理活性（后者藥理活性顯著強于前者）。華法林的代謝過程涉及多種細(xì)胞色素P450酶，這些代謝酶催化華法林在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為系列單羥化代謝物，而少數(shù)華法林原型藥及絕大部分的代謝物經(jīng)腎臟代謝至尿液排出體外。CYP2C9是參與S-華法林代謝的主要酶，超過80%的S-華法林由該酶催化為主要的無活性代謝物S-7-羥基華法林及S-6-羥基華法林[2]。但參與R-華法林代謝的主要是CYP1A2，CYP2C19，CYP3A4，而并非CYP2C9，這3個代謝酶可分別將R-華法林催化為R-6-羥基華法林、R-8-羥基華法林及R-10-羥基華法林[2-3]。華法林的這些單羥化代謝物還可通過葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步代謝[4]。

鑒于CYP2C9基因多態(tài)性且與活性更強的S-華法林的代謝清除相關(guān)，在接受華法林治療前應(yīng)明確特定患者的CYP2C9基因型。CYP2C9*3等位基因（lle359Leu）是其最常見的功能受損的變異基因型，體外試驗提示其能降低 90%S-華法林的代謝[5-9]。當(dāng)CYP2C9*3純合子患者接受常規(guī)劑量華法林治療時，往往面臨著非常高的過度抗凝風(fēng)險，除非將華法林劑量下調(diào)70%[6]。因此，CYP2C9基因型是華法林與其他藥物相互作用的一個重要決定因素。

盡管華法林的相關(guān)研究已持續(xù)了許多年，但在川東北地區(qū)CYP2C9基因多態(tài)性的患者群體中，華法林的藥代動力學(xué)研究尚未見報道。同時，目前尚不清楚川東北地區(qū)患者體內(nèi)華法林代謝是否會因CYP2C9基因的多態(tài)性而改變，從而涉及其他途徑或酶，這可能會影響臨床對華法林與其他藥物相互作用的評估與預(yù)測。為此，本研究中對川東北地區(qū)CYP2C9基因型患者體內(nèi)華法林對映體的藥代動力學(xué)進(jìn)行了考察，旨在明確CYP2C9基因多態(tài)性對華法林代謝過程的影響，為華法林的臨床合理應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；TSQ型量子三重四極質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。華法林鈉片（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H31022123，規(guī)格為每片2.5 mg）；R-華法林（批號為113027，純度為98%），S-華法林（批號為114249，純度為98%），均購自美國Sigma公司；甲氯噻嗪（吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司，純度為99.6%）；試驗所用試劑均為色譜純，水為超純水。

1.2 研究對象

納入標(biāo)準(zhǔn)：川東北地區(qū)本地居民；年齡18～61歲；肝腎功能正常；心臟瓣膜置換術(shù)后服用華法林進(jìn)行抗凝治療；無吸煙史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：對本研究擬用藥物過敏；住院期間使用過阿司匹林、巴比妥及奎尼丁等藥物；有出血傾向；住院期間使用過CYP2C9或CYP3A4的底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑或激活劑類藥物。

1.3 方法

DNA分離和基因型測定：收集患者血液，室溫下從全血中提取DNA。采用基因型應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測CYP2C9基因型。

試驗設(shè)計：根據(jù)基因檢測結(jié)果，選取11例CYP2C9*1／*1基因型，8例 CYP2C9*1／*3基因型，6例CYP2C9*2／*3基因型，9例 CYP2C9*3／*3基因型患者。給予華法林鈉片，前3天每日劑量為3 mg，隨后每日維持劑量為4 mg。連續(xù)給藥30 d，末次給藥后，檢測華法林對映體在血液及尿液中的質(zhì)量濃度。試驗前6 d至研究結(jié)束期間避免使用任何已知CYP2C9或CYP3A4的底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑或激活劑，同時避免攝入咖啡因。

生物樣品收集與處理：末次給藥后 2，6，24，48，72，96，120，144，168，216，264，312，360 h 時取血液樣品各 2 mL，置肝素化離心管，3 000 r／min 離心 20 min，取血漿貯存于-20℃待測。末次給藥后，分別于0，72，144，216 h收集24 h的排尿量，并冷藏貯存。在每個間隔，記錄尿總量，并取20 mL置-20℃貯存待測。取血漿或尿液樣品200 μL，加入500 ng／mL甲氯噻嗪（內(nèi)標(biāo)）50 μL，隨后依次加入甲醇 -水（50 ∶50，V／V）50 μL，0.2 mol／L 磷酸溶液 100 μL，水 300 μL，混合；渦流1 min后，加入乙醚 -二氯甲烷 （3∶2，V／V）3 mL，渦旋 5 min，3 500 r／min 離心 5 min，取全部上清液，氮氣吹干，最終以 5 mmol／L醋酸銨溶液（pH 4.0）-乙腈（72 ∶28，V／V）300 μL 復(fù)溶。

試驗條件：使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。色譜柱為 Astec ChirobioticTMV 柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為 5 mmol／L醋酸銨溶液（pH 4.0）-乙腈（72 ∶28，V／V）；流速 1.5 mL／min（柱后分流，離子源 -廢液體積比為 1 ∶2，V／V）；進(jìn)樣量 5.0 μL。上述操作均在醫(yī)院基因檢測實驗室進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

藥-時曲線由GraphPad 5.0軟件繪制；相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)由DAS 2.0軟件分析。采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以表示，行t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，行 χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對 R-華法林血藥濃度及尿排泄的影響

R-華法林的血藥濃度及尿排泄在CYP2C9不同基因型患者間無顯著差異，詳見圖 1。R-華法林藥代動力學(xué)參數(shù)在CYP2C9不同基因型患者間無顯著差異，詳見表 1。結(jié)果表明，R-華法林藥代動力學(xué)過程不受CYP2C9基因多態(tài)性影響。

2.2 對 S-華法林血藥濃度及尿排泄的影響

CYP2C9*1／*1基因型患者體內(nèi)S-華法林的血藥濃度及尿排泄量顯著低于其他基因型，CYP2C9*1／*3和 CYP2C9*2／*3基因型次之，而 CYP2C9*3／*3基因型患者體內(nèi)S-華法林血藥濃度及尿排泄量最高，詳見圖 2。CYP2C9*1／*1基因型患者體內(nèi)S-華法林半衰期（t1／2）顯著小于其他基因型，清除率（CL）顯著高于其他基因型；而CYP2C9*3／*3基因型患者體內(nèi)S-華法林t1／2顯著高于其他基因型，CL顯著低于其他基因型，詳見表 2。結(jié)果表明，CYP2C9*1／*1基因型患者體內(nèi)華法林代謝最快，而CYP2C9*3／*3基因型患者體內(nèi)華法林代謝最慢。

3 討論

藥物代謝酶是藥代動力學(xué)過程中的重要調(diào)節(jié)因素，其直接參與藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程。明確藥物的代謝酶可規(guī)避臨床潛在的不利于治療目的的藥物相互作用，進(jìn)一步闡明代謝酶基因多態(tài)性對藥物代謝的差異，能針對不同患者制訂合理的個體化給藥方案，從而提升臨床藥物治療的安全性。

表1 不同基因型患者體內(nèi)R-華法林主要藥代動力學(xué)參數(shù)（±s）

表1 不同基因型患者體內(nèi)R-華法林主要藥代動力學(xué)參數(shù)（±s）

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注：與 CYP2C9*1／*1基因型比較，#P ＜0.05。

表2 不同基因型患者體內(nèi)S-華法林主要藥代動力學(xué)參數(shù)（±s）

表2 不同基因型患者體內(nèi)S-華法林主要藥代動力學(xué)參數(shù)（±s）

注：與 CYP 2 C 9*1／*1基因型比較，#P＜0.05；與CYP2C9*3／*3基因型比較，*P＜0.05。

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明確川東北地區(qū)不同基因型患者體內(nèi)華法林的藥代動力學(xué)過程，結(jié)合藥物基因檢測及國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）進(jìn)行精準(zhǔn)給藥，則能規(guī)避臨床抗凝過度或不足，也能降低治療過程中毒性反應(yīng)的發(fā)生。S-華法林的藥理活性顯著強于R-華法林，且其代謝主要經(jīng)CYP2C9介導(dǎo)。因此，本研究中首先通過藥物基因檢測技術(shù)篩選接受華法林治療患者的CYP2C9基因型，同時考察各基因型患者體內(nèi)華法林對映體的質(zhì)量濃度，從而評價CYP2C9基因多態(tài)性對華法林藥代動力學(xué)的影響。

疾病可能會影響機體內(nèi)轉(zhuǎn)運體或代謝酶的表達(dá)，因此針對特定患者直接進(jìn)行相關(guān)治療藥物藥代動力學(xué)研究的臨床意義可能優(yōu)于正常志愿者的藥代動力學(xué)。本研究中選取南充市中心醫(yī)院34例心臟瓣膜置換術(shù)后接受華法林抗凝治療的患者作為研究對象。為了排除研究中其他合用藥物對華法林藥代動力學(xué)的影響，篩選的患者在接受華法林治療時均未使用其他CYP2C9代謝酶的誘導(dǎo)劑或抑制劑。鑒于抗凝治療期間華法林通常是每天維持給藥，為了能監(jiān)測到華法林單次體內(nèi)消除過程，于患者末次給藥后檢測R-華法林、S-華法林及其代謝物，同時收集每天尿液，用于檢測尿中藥物含量。結(jié)果提示，CYP2C9基因多態(tài)性患者對R-華法林的藥代動力學(xué)無顯著影響，而CYP2C9*1／*1基因型患者S-華法林的血藥濃度及尿排泄量最低，而CYP2C9*1／*3及CYP2C9*2／*3次之，CYP2C9*3／*3 基因型患者S-華法林的血漿暴露及尿排泄量最高。這表明CYP2C9*3／*3基因型患者體內(nèi)華法林的消除極慢，若不適當(dāng)調(diào)整劑量可能會導(dǎo)致過度抗凝，而CYP2C9*1／*1基因型患者則可能出現(xiàn)抗凝效果不佳的情況。鑒于華法林的抗凝效果往往也和VKORC1基因多態(tài)性有關(guān)聯(lián)，且不同患者的生理條件及飲食習(xí)慣都不盡相同。因此，為了更加合理地調(diào)整華法林的劑量，臨床醫(yī)師及藥師應(yīng)進(jìn)行代謝酶及結(jié)合位點的基因檢測和血藥濃度監(jiān)測，并結(jié)合INR，對不同的患者進(jìn)行個體評估、調(diào)整。