兩種乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑的檢驗(yàn)重復(fù)性與一致性比較

華燕美

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)不僅可引起人類急、慢性肝炎，還能進(jìn)展為肝硬化，甚至是肝癌，并且肝癌死亡率較高[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA持續(xù)復(fù)制水平越高，發(fā)生肝癌的可能性就越大[3]。因此，評價(jià)乙型肝炎治療效果和預(yù)后最重要也是最直觀的方法就是檢測HBV核酸定量檢測[4-5]。目前, 國內(nèi)出現(xiàn)了一系列商品化HBV核酸檢測試劑盒，但其與國外進(jìn)口原裝試劑盒之間的性能差異尚不明確。因此，本文選擇了羅氏原裝與國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒進(jìn)行了重復(fù)性與一致性比較。

資料與方法

一、樣本來源

使用WHO HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品，先用0.5mL去離子水溶解，再用陰性人血清梯度稀釋至所需滴度，HBV DNA 滴度分別為60、170、1 700、17 000 IU/mL，每個滴度檢測20次。收集2016 年8月—12月在我院正在接受乙肝抗病毒治療的患者或復(fù)診患者血清，HBV DNA 載量為<50、50～200、～102、～103、～104、～105、～106、～107、～108 IU/mL，每組10例，年齡29～57歲，樣本抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV均為陰性。

二、研究方法

HBV核酸定量檢測羅氏試劑使用平臺：cobasAmpliPrep/cobasTaqMan,采用羅氏HBV DNA定量檢測試劑盒(靈敏度20 IU/mL，線性范圍20～1.7×108IU/mL)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。國產(chǎn)試劑使用平臺：核酸提取儀DP1 000、Cobas Z480實(shí)時熒光定量PCR儀，采用國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(靈敏度50 IU/mL，線性范圍50～5.0×108IU/mL)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。大致步驟如下：采用磁珠法進(jìn)行提取HBV DNA后，然后進(jìn)行低速離心，將樣品加入到定量PCR儀中， 50℃反應(yīng)2min，在94℃下進(jìn)行保溫5 min，進(jìn)行94℃ 10 s～60℃ 45 s循環(huán)，完成40個循環(huán)，60℃采集熒光通道信號，并計(jì)算各樣本HBV DNA含量(IU/mL)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素方差分析(ANOVA)檢測操作者間或操作者內(nèi)差異，計(jì)算組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(ICC)判斷組內(nèi)一致性。計(jì)算兩者間相關(guān)系數(shù)R，進(jìn)行Bland-Altman圖繪制。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 兩種試劑的溯源性和重復(fù)性

3名操作者分別對WHO標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA樣品(17 000 U/mL)進(jìn)行檢測：羅氏檢測測結(jié)果分別為(1.66±0.13)、(1.68±0.21)、(1.66±0.11)×104IU/mL國產(chǎn)檢測結(jié)果分別為(1.89±1.51)、(1.62±1.66)、(2.13±1.45) ×105IU/mL。三名操作者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(羅氏F=2.59，P>0.05；國產(chǎn)F=2.06,P>0.05)，說明不同操作者間重復(fù)性良好。

從3名操作者中隨機(jī)抽取1人，隔日對每一樣本重復(fù)測量3次，羅氏檢測結(jié)果分別為(1.66±0.13)、(1.67±0.12)、(1.69±0.13)×105IU/mL,國產(chǎn)檢測結(jié)果分別為(1.89±1.51)、(1.92±1.71)、(1.74±1.65) ×105IU/mL。同一操作者內(nèi)操作差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(羅氏F=1.02,P>0.05；國產(chǎn)F=1.16,P>0.05)，說明同一操作者不同操作間重復(fù)性良好。

兩種試劑檢測4個滴度(60、170、1 700、17 000 IU/mL)的WHO HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品，每個滴度分別檢測24次，均值及SD見表1。羅氏檢測試劑ICC值為0.93(F=12.51,P<0.0001)，國產(chǎn)檢測試劑ICC值為0.82(F=8.72,P<0.0001)，羅氏檢測試劑組內(nèi)重復(fù)性優(yōu)于國產(chǎn)試劑。

表1 兩種HBV DNA定量重復(fù)檢測HBV DNA 標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果(以對數(shù)形式表示)

二、兩種試劑的一致性

兩種試劑檢測9組不同HBV DNA滴度的患者血清樣本，每組10例，結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者相關(guān)系數(shù)r=0.849,P<0.0001，相關(guān)性良好(圖1)。兩組臨床血清檢測的Bland-Altman圖，可見兩種檢測試劑結(jié)果差值90%的位點(diǎn)位于95%置信區(qū)間參考范圍內(nèi)，說明兩種檢驗(yàn)方法間一致性良好(圖2)。

圖1 兩種乙型肝炎病毒核酸檢測試劑檢測結(jié)果的相關(guān)圖

注：虛線代表Y=0，其他三條線分別代表Y=兩種方法差值均數(shù)，Y=兩種方法差值均數(shù)+1.96SD；以及Y=兩種方法差值均數(shù)-1.96SD。

圖2兩種乙型肝炎病毒核酸檢測試劑差異Bland-Altman圖

討 論

HBV DNA的病毒載量通常被認(rèn)為是衡量HBV 復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6-8]。HBV DNA的定量檢測是檢測病毒拷貝數(shù)最直接、最可信賴的方法，可以幫助確診隱性HBV感染和隱性慢性乙型肝炎，并對乙肝活動期患者的病毒監(jiān)控提供臨床指導(dǎo)意義[9-11]。目前，在我國檢測乙型肝炎病毒核酸定量的檢測試劑盒種類繁多，除了最經(jīng)典的羅氏原裝進(jìn)口試劑盒外，還有國產(chǎn)試劑盒生產(chǎn)商包括湖南圣湘、上海科華等等。由于不同HBV檢測試劑可能會帶來不同的結(jié)果[12],這使得檢驗(yàn)報(bào)告不能給醫(yī)生的臨床治療帶來有效的指導(dǎo)，也使得不同實(shí)驗(yàn)室之間無法互認(rèn)，出現(xiàn)交流障礙。因此，對不同檢驗(yàn)試劑進(jìn)行重復(fù)性與一致性評價(jià)，并分析之間的相關(guān)性具有重要的臨床意義。

本課題組選擇了羅氏原裝與國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑進(jìn)行了WHO標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA樣品和患者血清樣本檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅氏檢測結(jié)果更接近于真實(shí)值，數(shù)值波動程度小。3名操作者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同操作者間重復(fù)性良好。同一操作者內(nèi)操作差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明同一操作者不同操作間重復(fù)性良好。而組內(nèi)一致性檢測發(fā)現(xiàn)羅氏試劑ICC值為0.88(P<0.01)，國產(chǎn)試劑為0.74(P<0.01)，證實(shí)了羅氏檢測試劑重復(fù)性優(yōu)于國產(chǎn)試劑。這可能是因?yàn)閲a(chǎn)和進(jìn)口試劑盒在病毒載量損耗和試劑制備方面的不同，影響了定量檢測結(jié)果的重復(fù)性。類似的是，有學(xué)者報(bào)道國產(chǎn)試劑盒在產(chǎn)品的整體設(shè)計(jì)上已基本達(dá)到國外同類產(chǎn)品水平，但實(shí)際上靈敏度及檢測下限方面卻有著較大波動[13-14]。因此，國產(chǎn)HBV DNA定量檢測試劑仍需進(jìn)一步改進(jìn)并提高檢測質(zhì)量。

本課題組進(jìn)一步進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)系數(shù)r=0.849,P<0.0001，相關(guān)性良好(圖1)。而Bland-Altman圖可見兩種檢測試劑結(jié)果差值90%的位點(diǎn)位于95%置信區(qū)間參考范圍內(nèi)，說明兩種檢驗(yàn)方法一致性良好(圖2)。由此可見，雖然國產(chǎn)試劑重復(fù)性低于羅氏原裝進(jìn)口試劑盒，但兩者檢測結(jié)果一致性較好，說明國產(chǎn)HBV DNA定量檢測試劑作為一種廉價(jià)高效檢測手段具有良好的應(yīng)用前景，可以在貧困偏遠(yuǎn)地區(qū)進(jìn)行普查或者臨床上進(jìn)行輔助使用。在需要對結(jié)果進(jìn)一步精確測定時應(yīng)選擇羅氏原裝試劑，是臨床應(yīng)用的“金標(biāo)準(zhǔn)”。利用羅氏原裝試劑作為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)和監(jiān)測，可以實(shí)現(xiàn)HBV DNA定量測定結(jié)果的一致，保證為臨床醫(yī)生質(zhì)量提供指導(dǎo)的準(zhǔn)確性。