結(jié)合肽P201與5-氟尿嘧啶聯(lián)合用藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用及抗耐藥分子機(jī)制

郭紅萍，敖智廣，王雋，王思怡，付鵬德，劉新榮，茆燦泉

西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031

肝癌是世界第二大癌癥死亡原因，其發(fā)病率逐年增高[1]。肝癌細(xì)胞對(duì)放射治療不敏感,同時(shí)具有對(duì)各種細(xì)胞毒性化療藥物的多藥耐受（multi-drug resistance，MDR）特性[2]。MDR1又稱P-糖蛋白，屬于ATP結(jié)合盒式（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，是一種跨膜泵，用于清除多種有毒化合物，包括主要的癌癥化療藥物[3]，且ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同樣是與腫瘤多藥耐藥有關(guān)的新的藥物排出泵。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5FU）是一種常用的化療藥物，可治療多種惡性腫瘤，然而由于5FU耐藥性的頻繁發(fā)生，化療效果有限[4-5]。叉頭盒 M1（forkhead box M1，F(xiàn)oxM1）轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞周期進(jìn)程[6]、轉(zhuǎn)移[7]和耐藥的關(guān)鍵叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子家族成員[8]，具有保守的翼螺旋DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)展示技術(shù)，獲得了對(duì)FoxM1-DBD有高親和力的結(jié)合肽P201[10]，且已證實(shí)多肽9R-P201可以顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖、遷移與侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。在本研究中，我們通過(guò)多種方法探討P201+5FU聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用及抗耐藥分子機(jī)制，期望為克服腫瘤化療耐藥瓶頸提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

人源肝癌HepG2細(xì)胞；9R-P201（上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，純度98.0%）；5FU（Sigma公司）；胎牛血清（Gibco公司）；CCK-8試劑盒、AOEB熒光雙染試劑盒、AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（賽默飛世爾科技公司）；熒光定量PCR試劑盒（羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司）；抗FoxM1、MDR1鼠單克隆抗體，羊抗鼠IgG-Biotin二抗（武漢博士德公司）。

1.2 CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將 HepG2 細(xì)胞以 5.0×103/孔接種 100.0 μL 于96孔板，實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組、P201組（45.0、50.0 μg/mL）、5FU組（80.0、100.0 μg/mL）、P201+5FU聯(lián)合用藥組［P201（45.0 μg/mL）+5FU（80.0 μg/mL）、P201（45.0 μg/mL）+5FU（100.0 μg/mL）、P201（50.0 μg/mL）+5FU（80.0 μg/mL）］，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到達(dá)處理時(shí)間后觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，后加CCK-8試劑，避光孵育1.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：

其中，D0為調(diào)零組吸光度值，D1為實(shí)驗(yàn)組吸光度值，D為對(duì)照組吸光度值。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞按2.5×103/孔鋪至6孔板，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后用200.0 μL無(wú)菌槍頭劃痕，各實(shí)驗(yàn)組分別處理細(xì)胞24和48 h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照，最后用Image J軟件定量細(xì)胞遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

各實(shí)驗(yàn)組處理48 h后調(diào)整HepG2細(xì)胞濃度至 2.5×103/mL，按 200.0 μL/孔將細(xì)胞懸液加到Transwell小室的上室中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 吖啶橙/溴化乙錠（AO-EB）熒光雙染

HepG2細(xì)胞按2.5×104/孔鋪至6孔板后加藥處理48 h，加入預(yù)先配置的AO-EB工作液（20.0 μL AO 儲(chǔ)液+20.0 μL EB 儲(chǔ)液+100.0 μL PBS，混勻后避光儲(chǔ)存），熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞處理48 h后，分組收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，從中取 2.0×103～2.5×103細(xì)胞，離心去上清，加入500.0 μL AnnexinⅤ-FITC/PI結(jié)合緩沖液重懸，再依次加入5.0 μL AnnexinⅤ-FITC、5.0 μL PI混勻，室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀（Beckman公司）檢測(cè)分析。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞按1.0×103/孔鋪至培養(yǎng)皿（直徑6 cm），37℃孵育24 h后加藥處理，后每隔3 d換含有各處理藥的培養(yǎng)液，處理14 d到達(dá)作用時(shí)間后，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗脫3次，拍照，以克隆數(shù)＞50計(jì)作1個(gè)克隆。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 qRT-PCR

將HepG2細(xì)胞按2.5×103/孔鋪至6孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，加藥處理48 h。TRIzol法提取樣本總RNA，再用Invitrogen M-MLV第一鏈合成試劑盒合成總cDNA。采用FastStart DNA Green Master（Roche公司）試劑盒，在LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司）上進(jìn)行qRT-PCR。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。檢測(cè)基因及內(nèi)參GAPDH的引物信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.9 Western印跡

各加藥處理組作用HepG2細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，取30.0 μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育過(guò)夜，TBST清洗，二抗孵育2 h，洗膜，ECL顯色曝光。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8和SPSS 22軟件處理，結(jié)果以x±s表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為顯著差異，P＜0.001為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 多肽P201+5FU聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制殺傷作用

圖1 CCK-8法測(cè)定加藥處理24（A）、48 h（B）后HepG2細(xì)胞的存活率

如圖1所示，聯(lián)合用藥組處理HepG2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組比較，均能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞殺傷作用增強(qiáng)。與相同濃度的單藥 P201（45.0 μg/mL）、5FU（100.0 μg/mL）相比較，聯(lián)合用藥組［P201（45.0 μg/mL）+5FU（100.0 μg/mL）］對(duì)細(xì)胞的抑制殺傷作用更強(qiáng)，且差異極顯著（P＜0.001），兩藥具有協(xié)同作用。因此，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中聯(lián)合用藥最優(yōu)處理時(shí)間為48 h，最優(yōu)聯(lián)合濃度為P201（45.0 μg/mL）+5FU（100.0 μg/mL），后續(xù)實(shí)驗(yàn)均照此處理。

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用

圖2A示AO-EB熒光雙染。處理48 h后對(duì)照組細(xì)胞大小、形態(tài)均勻，呈綠色熒光；各加藥組細(xì)胞形狀呈不規(guī)則變化，核染色質(zhì)出現(xiàn)程度不一的固縮和橙色熒光，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征，且聯(lián)合用藥組具有凋亡特征的細(xì)胞比例呈顯著上升趨勢(shì)。這也被進(jìn)一步的AnnexinⅤ/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析所確認(rèn)（圖2B），5FU、P201及聯(lián)合用藥組早期凋亡率分別為8.04%、7.75%和19.73%，晚期凋亡率分別為11.37%、17.41%和23.68%。

圖2 加藥處理對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞增殖與遷移能力的影響

由圖3可知，聯(lián)合用藥處理HepG2細(xì)胞后，與對(duì)照組及各單藥處理相比，其克隆形成能力、遷移距離均明顯下降。加藥處理后各組培養(yǎng)14 d，對(duì)照組克隆數(shù)顯著高于各加藥處理組，單藥處理有少量克隆數(shù)，而聯(lián)合用藥組未出現(xiàn)細(xì)胞克隆數(shù)（圖3A）。聯(lián)合用藥組處理24、48 h后HepG2細(xì)胞劃痕愈合能力均呈減弱趨勢(shì)，與對(duì)照組和各單藥處理相比差異顯著（P＜0.01）（圖3C、E）。進(jìn)一步的Transwell實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這種遷移抑制作用，聯(lián)合用藥組HepG2細(xì)胞遷移率僅為對(duì)照的10%（圖3B、D）。

2.4 聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞中FoxM1和mdr1等相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果如圖4A、B，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞經(jīng)5FU單獨(dú)處理48 h后，F(xiàn)oxM1下調(diào)，mdr1上調(diào)；經(jīng)P201單獨(dú)處理后mdr1下調(diào)；聯(lián)合用藥組FoxM1、mdr1均顯著下調(diào)。這與蛋白水平結(jié)果一致，且ABCG2蛋白水平下調(diào)（圖4C、D）。聯(lián)合用藥組抑制FoxM1、mdr1和ABCG2的表達(dá)作用更強(qiáng)，結(jié)果具有顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論

化療是目前癌癥治療的主要途徑之一。然而，腫瘤細(xì)胞對(duì)幾乎所有化療藥物和靶向藥物的耐藥性已成為普遍現(xiàn)象。自發(fā)現(xiàn)系列耐藥蛋白以來(lái)，藥物外排抑制一直是采用維持化療藥物細(xì)胞內(nèi)濃度來(lái)克服耐藥性的主要策略[12]。新的證據(jù)表明，F(xiàn)oxM1水平升高會(huì)促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，并與人類癌癥的多種侵襲性和化療耐藥性有關(guān)[13]。本課題組自2007年起即開(kāi)展FoxM1的研究工作，結(jié)合噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選，獲得了多條對(duì)FoxM1蛋白有高親和力的結(jié)合肽[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，P201多肽可通過(guò)顯著下調(diào)FoxM1的表達(dá)從而對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生選擇性殺傷作用。同時(shí)裸鼠肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤模型結(jié)果顯示，P201（60.0 μg/mL）處理后FoxM1下調(diào)，但5FU化療藥對(duì)肝癌移植瘤模型中FoxM1的表達(dá)不敏感[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)oxM1的過(guò)表達(dá)往往與腫瘤細(xì)胞的化藥耐藥有關(guān)，這也可能是部分癌細(xì)胞對(duì)5FU產(chǎn)生耐藥性的原因[14]。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥是腫瘤治療中遇到的嚴(yán)重障礙，MDR可以保護(hù)癌細(xì)胞免受各種結(jié)構(gòu)和功能不同的藥物的傷害，是腫瘤化療中的一個(gè)主要問(wèn)題[15]。

我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)9R-P201可直接或間接地調(diào)控HepG2細(xì)胞中數(shù)千個(gè)差異表達(dá)mRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），參與了多個(gè)癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路[16]。為此，本研究設(shè)計(jì)了P201聯(lián)合化療藥5FU的用藥方式，擬通過(guò)P201抑制FoxM1在肝癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，使肝癌HepG2細(xì)胞重新對(duì)化療藥5FU產(chǎn)生敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P201+5FU聯(lián)合用藥處理48 h后，其對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率均顯著高于單獨(dú)用藥，差異極顯著。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡和遷移的抑制作用顯著強(qiáng)于各單獨(dú)用藥，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為進(jìn)一步探索P201+5FU聯(lián)合用藥對(duì)肝癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用及抗耐藥分子機(jī)制，我們還采用qRT-PCR和Western印跡檢測(cè)相關(guān)耐藥基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥處理HepG2細(xì)胞后FoxM1、mdr1、ABCG2等耐藥基因和蛋白顯著下調(diào)。

圖3 加藥處理對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及遷移能力的影響（200×）

綜上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)P201靶向FoxM1抗癌作用機(jī)制的揭示，提示P201可能通過(guò)對(duì)FoxM1/mdr1信號(hào)通路的抑制，一方面直接殺傷細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)影響和降低mdr1等耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)5FU的敏感性并可能維持胞內(nèi)5FU濃度，增強(qiáng)細(xì)胞的殺傷作用。本研究為克服腫瘤化療耐藥瓶頸提供了新思路。

圖4 qRT-PCR和Western印跡檢測(cè)加藥處理后HepG2細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)