噬菌體抗體庫技術(shù)篩選抗VEGF165單克隆抗體

詹明碩，劉方杰，張亞蘭

1.北京城市學(xué)院 生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083；2.北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司，北京 100176

據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機構(gòu)（InternationalAgency forResearch on Cancer，IARC）最新公布的全球癌癥數(shù)據(jù)報告估計，2018年全球癌癥新病例增至1810萬例，死亡病例增至960萬例。由此可見，癌癥發(fā)病率逐年升高，已成為影響人類健康及減少壽命的第一大因素。目前，以單克隆抗體為代表的抗體療法成效顯著，隨著新的單克隆抗體靶點的發(fā)現(xiàn)，有近百種單克隆抗體作為治療型藥物被批準(zhǔn)上市，廣泛應(yīng)用于當(dāng)前疾病的治療中。

惡性腫瘤的生長遷移依賴于血管形成。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，在腫瘤生長中發(fā)揮重要作用。根據(jù)不同的剪切方式，VEGF-A分為5種亞型，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和 VEGF206，其中VEGF165是VEGF-A最重要的同源單體，在細胞內(nèi)含量最多，分裂原性也最強。VEGF主要通過與細胞表面的VEGF受體2（VEGFR2）結(jié)合，激活VEGFR2，產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)多種細胞內(nèi)通路調(diào)控，內(nèi)皮細胞分裂、存活、萌發(fā)和遷移[1]。腫瘤細胞通過大量表達VEGF，利用VEGF/VEGFR通路，以血管為主的脈管大量生長，為腫瘤生長提供了氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。通過研發(fā)新型抗體藥物與VEGFR競爭性結(jié)合VEGF，可以阻斷VEGF/VEGFR信號通路，減少血管形成，進而影響細胞分裂、遷移，發(fā)揮抗腫瘤的功效。

噬菌體展示技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗體篩選，在全人源抗體、小分子抗體、高特異性抗體等研發(fā)中發(fā)揮了巨大優(yōu)勢，已發(fā)展成為抗體藥物研發(fā)的重要技術(shù)手段[2]。表面展示和免疫動物是目前常用的2種方法。免疫動物接種在抗體研發(fā)中曾發(fā)揮重要作用，但是針對有毒抗原及半抗原的單克隆抗體制備則呈現(xiàn)明顯缺陷和不足[3]。相比雜交瘤免疫小鼠較為復(fù)雜的方法制備單克隆抗體，噬菌體展示完全在體外進行，具有制備周期短、篩選范圍廣等優(yōu)點。1985年，Smith[4]發(fā)明了噬菌體展示技術(shù)，在噬菌體外殼表面展示蛋白質(zhì)，噬菌體內(nèi)部則包含了對應(yīng)蛋白的編碼基因，其價值體現(xiàn)在可使基因型和表型建立直接聯(lián)系，通過這種方式，大量蛋白質(zhì)可以在體外被篩選和擴增。其后，McCafferty等[5]將噬菌體展示技術(shù)用于抗體進化，以生產(chǎn)新的藥物。

本研究中，我們利用噬菌體展示技術(shù)從抗體庫中篩選出抗VEGF165的單克隆抗體VG2。一系列的功能研究顯示，VG2抗體具有較高的親和力，能夠阻斷VEGF/VEGFR信號通路，并能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

293E細胞株、載體pX、輔助噬菌體M13KO7均由本實驗室保存；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；ELISA二抗、重組人源蛋白VEGF165購自北京義翹神州生物技術(shù)股份有限公司；抗人抗體購自Sigma公司；引物由上海捷瑞生物技術(shù)股份有限公司合成。

1.2 噬菌體抗體庫的制備

取30 μL合成抗體庫甘油菌，接種至50 mL 2×YT CG培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)約3 h至菌液D600nm為0.6～0.8，吸取10 mL培養(yǎng)液至50 mL離心管中，加入20 μL輔助噬菌體M13KO7混勻，37℃靜置 30 min，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，6000 r/min離心 15 min，棄上清，沉淀重懸于含50 mL 2×YT CK培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃、220 r/min振蕩過夜，將過夜菌轉(zhuǎn)至50 mL離心管，4℃、4200 r/min離心 15 min，取 10 mL PEG/NaCl加40 mL上清液至新的離心管中混勻，冰浴1 h，4℃、4000 r/min離心20 min，棄上清，噬菌體重懸于5 mL含20%甘油的PBS中，即得到純凈的噬菌體懸液。

1.3 噬菌體抗體庫的親和淘選

取2支免疫管，紫外燈下滅菌15 min；用無菌PBS將VEGF165稀釋至終濃度為1 mg/mL，加500 μL 溶液至免疫管中，同時加 500 μL 無菌PBS至另一支免疫管，設(shè)置陰性對照，4℃包被過夜；向免疫管中加入4%脫脂奶粉，室溫孵育1 h，同時用4%脫脂奶粉封閉噬菌體抗體庫1 h；棄封閉液，分別向2支管中加入500 μL封閉后的抗體庫，混勻，室溫孵育1 h；用PBST振蕩洗滌免疫管20次，再用PBS振蕩洗滌5次，每次振蕩2.5 min；向免疫管中加入500 μL Gly-HCl（pH2.2）洗脫噬菌體 10 min；用 35 μL Tris-HCl（pH8.8）中和洗脫后的噬菌體，重復(fù)洗脫1次。

復(fù)蘇接種大腸桿菌TG1，待菌液D600nm為0.6～0.8時取10 mL菌液，加入530 μL噬菌體洗脫液侵染，混勻，37℃靜置30 min，37℃、220 r/min振蕩30 min，4000 r/min離心15 min，棄上清，重懸菌體并涂布于2塊2×YT CG平板，37℃過夜培養(yǎng)，將菌落從平板上刮下，加20%甘油凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA篩選陽性克隆

挑取單克隆菌株，接種于每孔含1 mL 2×YT CG培養(yǎng)基的96孔深孔板，37℃、220 r/min振蕩過夜后，轉(zhuǎn)接至900 μL 2×YT CG培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～0.8，每孔加入100 μL輔助噬菌體M13KO7，混勻，37℃靜置 30 min，37℃、220 r/min 振蕩 30 min，25℃、1800 r/min 離心 15 min，棄上清，用 600 μL 2×YT CK培養(yǎng)基重懸沉淀，30℃、220 r/min振蕩過夜，離心收取上清，ELISA鑒定陽性克隆，交由測序公司進一步鑒定。

1.5 ELISA檢測噬菌體-抗體的結(jié)合能力

將測序正確的菌株接種至2×YT CG培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～0.8，向培養(yǎng)液中加入M13KO7進行感染并制備純凈的噬菌體-抗體蛋白；用PBS包被抗原VEGF165，4℃過夜，PBST洗板3次，拍干；每孔加250 μL 4%脫脂奶粉-PBST，37℃封閉1 h；加入系列梯度稀釋的噬菌體-抗體蛋白，100 μL/孔，37℃孵育 1 h；PBST洗板后，加入HRP標(biāo)記的抗M13單抗（1∶5000稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，加 TMB 顯色液，100 μL/孔，室溫顯色；用0.1 mol/L H2SO4終止顯色；測定D450nm值，用Graph-Pad Prism軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 pXH和pXL重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以測序正確的陽性克隆質(zhì)粒為模板，利用特異上下游引物，PCR擴增2條序列（反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性 30 s，按照 98℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s循環(huán)25次，72℃延伸2 min，4℃保持約30 min），產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收，用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SalⅠ酶切，回收目的片段亞克隆至pXH和pXL載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。

1.7 VG2抗體的表達及純化

將測序正確的陽性單克隆菌株pXH-VG2VH和pXL-VG2VL分別接種至100 mL 2×YT A培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，4℃、8000 r/min離心15 min，棄上清，用大提試劑盒提取質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。2種質(zhì)粒按1∶1混合，同時取3倍質(zhì)粒體積的轉(zhuǎn)染試劑PEI緩慢加至5 mL FreeStyle F17細胞培養(yǎng)基中，室溫靜置15 min，混合液轉(zhuǎn)入45 mL 293E細胞（1.6×106/mL），37℃、相對濕度80%、125 r/min培養(yǎng)6～7 d，4000 r/min離心20 min，收集上清，過濾后通過純化儀Protein A層析柱進行純化。

1.8 ELISA鑒定VG2抗體的結(jié)合活性

用 PBS稀釋抗原 VEGF165至 1 μg/mL，加入96孔ELISA板中，4℃包被過夜；PBST洗板3次，拍干，每孔加250 μL 4%脫脂奶粉-PBST，37℃封閉1 h；將VG2從1 μg/mL開始進行1/3梯度稀釋，共設(shè)置10個稀釋梯度，并將稀釋液加至96孔板，100 μL/孔，37℃孵育 1 h；PBST 洗板后，向 96孔板中加入HRP標(biāo)記的鼠抗人Fc單抗（1∶5000稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，加TMB 顯色液，100 μL/孔，室溫顯色；用 0.1 mol/LH2SO4終止顯色；測定D450nm值，用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)。

1.9 競爭ELISA鑒定VG2抗體的功能

用 PBS稀釋抗原 VEGF165至 1 μg/mL，加入96孔ELISA板中，4℃包被過夜；PBST洗板3次，拍干，每孔加250 μL 4%脫脂奶粉-PBST，37℃封閉1 h；將VG2與VEGFR從摩爾比100∶1開始進行1/3梯度稀釋，共設(shè)置10個稀釋梯度，將稀釋液加至96孔板，100 μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板，向96孔板中加入HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單抗（1∶2000稀釋），100 μL/孔，37℃孵育 1 h；PBST洗板3次，加TMB顯色液，100 μL/孔，室溫顯色；用0.1 mol/L H2SO4終止顯色；測定D450nm值，用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)。

圖1 ELISA檢測噬菌體-抗體結(jié)合曲線

1.10 BIAcore法檢測VG2抗體的親和力

用胺基偶聯(lián)法將小鼠anti-human FC段抗體偶聯(lián)至CM5芯片表面，將1 μg/mL VG2抗體流經(jīng)芯片表面，保證捕獲約200響應(yīng)值（response unit，RU）的抗體；用HBS-EP緩沖液稀釋VEGF165至不同濃度（3、1、0.33、0.11、0.037、0.012、0.004 μg/mL），并將不同濃度的VEGF165流經(jīng)固定相表面；采用3 mol/L MgCl2溶液對芯片進行再生，用BIAcore 8K Evaluation Software進行擬合，獲得VG2抗體的KD值。

1.11 HUVEC增殖抑制檢測VG2抗體的功能

將生長狀態(tài)良好的HUVEC接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，5×103/孔，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16～24 h；用 EBM-2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基將 320 μg/mL的VG2抗體進行1/2系列稀釋，共設(shè)置7個濃度梯度；將100 ng/mL的VEGF165溶液等體積加入VG2抗體稀釋液中，輕輕混勻，37℃孵育0.5 h；每孔加入100 μL不同濃度的VG2和VEGF165混合液，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h；每孔加入20 μL CCK8溶液（輕拍混勻），37℃孵育約2.5 h，取出培養(yǎng)板，檢測D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 抗體庫的篩選

以VEGF165為抗原，從噬菌體抗體庫中篩選抗VEGF的單克隆抗體。1輪親和淘選后，從平板上隨機挑取168個克隆，加入輔助噬菌體，獲得展示單一抗體的噬菌體克隆。ELISA初步檢測噬菌體-抗體與VEGF165的結(jié)合能力，共獲得125個陽性克隆，陽性率為74%。挑選陽性克隆進行序列測定，獲得1個抗體序列，命名為VG2。

制備高純度的噬菌體-VG2，梯度稀釋ELISA檢測噬菌體-VG2與VEGF165的結(jié)合能力。將噬菌體-VG2從100 μg/mL開始進行1/3系列梯度稀釋，然后與VEGF165結(jié)合。anti-M13（HRP標(biāo)記）二抗檢測噬菌體-抗體與VEGF165的結(jié)合情況。實驗結(jié)果顯示，噬菌體-VG2能與VEGF165結(jié)合，呈劑量依賴關(guān)系。

2.2 VG2抗體表達載體構(gòu)建

以噬菌體抗體庫篩出的VG2質(zhì)粒為模板，用上下游特異引物分別擴增輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH）片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2，所得目的條帶約350 bp，條帶清晰且大小與預(yù)期相符。經(jīng)SalⅠ/NheⅠ雙酶切，輕鏈與重鏈分別克隆至pXL和pXH載體，經(jīng)序列測定，VG2全抗體表達載體構(gòu)建成功。

圖2 VL、VH擴增產(chǎn)物的電泳鑒定

2.3 VG2抗體的表達和純化

將測序正確的克隆進行質(zhì)粒大提，轉(zhuǎn)染293E細胞表達VG2抗體，再經(jīng)Protein A層析柱純化獲得VG2抗體。SDS-PAGE鑒定抗體純度，結(jié)果如圖3，還原電泳條件下VG2抗體重鏈和輕鏈的相對分子質(zhì)量分別約 50×103和 25×103，與理論值一致。非還原電泳條件下，在相對分子質(zhì)量約180×103處出現(xiàn)一條條帶，與預(yù)期一致。VG2樣品條帶清晰無雜帶，抗體純化后的純度達95%以上。

圖3 SDS-PAGE鑒定VG2抗體

2.4 VG2抗體與VEGF165結(jié)合能力檢測

利用梯度稀釋ELISA檢測VG2抗體與VEGF165的結(jié)合能力。將VG2抗體進行1/3梯度稀釋，然后與VEGF165結(jié)合，采用鼠抗人單克隆抗體（HRP標(biāo)記）檢測二者的結(jié)合情況。結(jié)果表明VG2抗體能與VEGF165結(jié)合，呈劑量依賴關(guān)系。經(jīng)GraphPad Prism繪制抗原抗體結(jié)合曲線（圖4），VG2抗體與VEGF165抗原結(jié)合的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）為6.455 ng/mL。

圖4 ELISA檢測全抗體結(jié)合曲線

2.5 競爭ELISA檢測VG2抗體的功能

ELISA檢測VG2阻斷VEGF165與VEGFR結(jié)合的能力。將VG2抗體進行1/3梯度稀釋，然后與VEGFR混合，將混合液加入包被VEGF165的ELISA板中，用抗His標(biāo)簽鼠單抗（HRP標(biāo)記）檢測VG2抗體的抑制能力。結(jié)果表明，VG2抗體能夠抑制VEGF165與VEGFR的結(jié)合，且呈劑量依賴關(guān)系。GraphPad Prism繪制競爭抑制曲線（圖5），VG2抗體的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.470 μg/mL。

圖5 競爭ELISA檢測全抗體結(jié)合曲線

2.6 BIAcore檢測VG2抗體的親和力

采用表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）檢測VG2抗體的親和力。將VG2抗體捕獲至CM5芯片表面，然后將不同濃度的VEGF165蛋白流經(jīng)芯片表面，用Biacore Evaluation Software進行擬合，獲得VG2抗體的KD值。結(jié)果表明，VG2抗體與VEGF165蛋白有很強的結(jié)合能力，KD=0.56 nmol/L（圖6）。

圖6 Biacore檢測VG2抗體的親和力

2.7 HUVEC增殖抑制檢測VG2抗體的功能

HUVEC主要用于研究血管生成相關(guān)功能實驗。VEGF165作用于HUVEC，可引起該細胞的增殖，因此可以利用該模型評價VG2抗體的功能。將HUVEC接種于細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，向細胞中加入不同濃度的VG2抗體與VEGF165混合液，在5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用CCK8法檢測HUVEC的增殖水平。結(jié)果顯示，VG2抗體能夠阻斷VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增殖，IC50=76.6 μg/mL（圖7）。

圖7 HUVEC增殖抑制曲線

3 討論

本研究成功地篩選出靶向VEGF165的全人源單克隆抗體VG2并制備了該抗體。功能實驗表明，該抗體具有較高的親和力，能阻斷VEGF/VEGFR2的結(jié)合，抑制HUVEC的增殖，為腫瘤治療提供基于該靶點的候選抗體藥物。

建庫之初選擇常規(guī)PCR方法，預(yù)先混合體系，擴增scFv，電泳條帶偏暗，擴增量較低。為使scFv的裝配更加高效，維持原VH與VL的比例，而把添加引物的時機選擇在2～3輪循環(huán)之后，改進后產(chǎn)量大幅提升。通過點突變得到的合成庫的庫容相較天然庫的數(shù)量級小了很多，但應(yīng)用性更強，小范圍較大概率地篩選出有親和力的抗體序列，節(jié)省了多輪篩選的時間。此外，庫容的豐度與大小也應(yīng)取決于抗體基因片段的多樣、載體的質(zhì)量及轉(zhuǎn)化細胞的質(zhì)量和數(shù)量，如抗體重鏈和輕鏈的獨立克隆可使文庫中的組合多樣性最大化。

已有研究表明，腫瘤細胞主要通過VEGF/VEGFR通路，在腫瘤內(nèi)部產(chǎn)生大量血管，為腫瘤生長提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)目前已發(fā)現(xiàn)的通路機制，針對VEGF靶點研制的常見抗體藥物有貝伐單抗（Bevacizumab）、雷珠單抗（Ranibizumab）、雷莫盧單抗（Ramucirumab）、阿柏西普（Aflibercept）、康柏西普（Conbercept）等。其中單克隆抗體藥物貝伐單抗（商品名Avastin）是由羅氏子公司基因泰克（Genetech）研制的一種重組人源化單克隆抗體，也是最早用于臨床的血管生成抑制劑，于2004年被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，后逐漸用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、非鱗狀非小細胞肺癌、復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種類型的癌癥及特定眼病[6-9]。

有多種文獻報道，抗VEGF藥物與其他藥物的聯(lián)用對增強藥效有一定幫助，作用機理更為復(fù)雜，有待進一步探究。多種藥物配合使用以達到預(yù)期治療效果是未來的方向，隨著VEGF/VEGFR通路機制的漸漸清晰，利用計算機更加精準(zhǔn)地輔助藥物設(shè)計、預(yù)測抗體結(jié)構(gòu)，將會有更多的抗體藥物面世，為患者帶來希望。