AlphaLISA檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素E方法的建立

張力文，趙俊清，鄭玉玲，律清宇，姜永強(qiáng),

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京 100071

金黃色葡萄球菌是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件在全國(guó)已占據(jù)第4位。金黃色葡萄球菌腸毒素是金黃色葡萄球菌食物中毒的主要因子，是一類(lèi)結(jié)構(gòu)相關(guān)、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質(zhì)，共有A～E、G～R17個(gè)血清型[3]。

金黃色葡萄球菌腸毒素E（Staphylococcus aureusenterotoxin E，SEE）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種超抗原[4]。作為一種新型的腸毒素，對(duì)它的研究還相對(duì)較少。SEE具有較好的熱穩(wěn)定性和較低的免疫原性，存在進(jìn)一步研究的價(jià)值[5]。因此，對(duì)SEE進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)是非常重要的。

AlphaLISA（amplified luminescentproximity homogeneous assay linked immunosorbent assay）是一種基于2個(gè)微球的技術(shù)[6]。當(dāng)2個(gè)微球彼此接近時(shí)，用波長(zhǎng)680 nm的光激發(fā)供體微球產(chǎn)生能量，將周?chē)磻?yīng)體系中的氧分子轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，并將能量傳遞給受體微球，最終產(chǎn)生520～620 nm的熒光。該技術(shù)操作便捷，用時(shí)少，均相免洗，能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)抗原進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AlphaLISA技術(shù)構(gòu)建了SEE的檢測(cè)方法，對(duì)該方法的重復(fù)性、特異性和靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)食品模擬樣本和金黃色葡萄球菌菌液上清中的SEE進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

10種金黃色葡萄球菌菌株（326E、1169、2-1、3-3、3-4、AT、A8、SC1、SC2和SC3）、SEE抗原、羊抗腸毒多克隆抗體和SEE小鼠單克隆抗體均為本實(shí)驗(yàn)室保存；食品購(gòu)自市場(chǎng)上的主要品牌商；AlphaLISA檢測(cè)使用的鏈霉親和素偶聯(lián)供體微球和受體微球?yàn)镻E公司合成；EZ-Link Sulfo-NHSLC-Biotin試劑盒為T(mén)hermo Science公司生產(chǎn)。

1.2 SEE小鼠單克隆抗體的生物素化

從冰箱中取出Sulfo-NHS-LC-Biotin，平衡至室溫，取2.2 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin溶于400 μL超純水中。在1 mg抗體溶液中加入30 μL配制好的生物素溶液，室溫孵育60 min，脫鹽柱純化，去除未結(jié)合的生物素，生物素標(biāo)記抗體存放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 受體微球同抗體的偶聯(lián)

將 25 μL AlphaLISA受體微球和 75 μL PBS（pH7.4）加到1.5 mL的EP管中，16 000 r/min離心15 min，棄上清，用100 μL PBS（pH7.4）洗滌2次。吸取1.6 μL 5 mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，加到18.4 μL去離子水中，振蕩混勻備用。吸取66.6 μL 50 mmol/L的HEPES緩沖液（pH7.4），加到洗滌好的微球中，超聲波混勻；隨后與33.4 μL 1.5 mg/mL的抗體、1.25 μL 10%的吐溫-20、10 μL配制好的氰基硼氫化鈉溶液混合（反應(yīng)總體系為111.25 μL），37℃孵育 24 h后，在反應(yīng)液中加入10 μL 65 mg/mL的羧甲氧基胺溶液（用800 mmol/L氫氧化鈉稀釋?zhuān)?7℃旋轉(zhuǎn)搖床中封閉1 h，16 000 r/min離心 15 min。移除上清，用100 μL 100 mmol/L 的 Tris-HCl（pH8.0）洗 滌 2次，用含0.05%Proclin-300的PBS（pH7.4）重懸并超聲，體積為100 μL，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)

10種金黃色葡萄球菌菌株各取50 μL，分別加到5 mL肉湯培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃振蕩培養(yǎng)12 h，12 000 r/min離心10 min，菌液上清經(jīng)20 μm濾膜過(guò)濾并存放于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 模擬樣本的制備

選取牛奶、夾心面包、火腿腸制備SEE的模擬樣本，實(shí)驗(yàn)前用R-Bio RIDASCREEN商業(yè)化試劑盒對(duì)食品原樣中是否含SEE進(jìn)行了檢測(cè)，確認(rèn)原樣中無(wú)SEE存在后，進(jìn)行模擬樣本的制備。

液態(tài)奶選取市場(chǎng)上三大品牌全脂牛奶。加入SEE之前，在無(wú)菌條件下，用PBS緩沖液按1∶1對(duì)牛奶進(jìn)行稀釋。用原奶和PBS稀釋的牛奶作為SEE的稀釋液，獲得含有不同濃度SEE的牛奶模擬樣本。

夾心面包選用某知名品牌，配料包括面粉、蛋、奶等多種物質(zhì)。稱(chēng)取0.4 g面包加到1 mL PBS中，用勻漿儀勻漿，加入PBS緩沖液，制成10%和20%的溶液，用這2種稀釋液對(duì)SEE進(jìn)行稀釋?zhuān)@得含有不同濃度SEE的面包模擬樣本。

火腿腸選取了某著名品牌。在無(wú)菌條件下稱(chēng)取0.4 g火腿腸加到1 mL PBS中，用勻漿儀勻漿，加入PBS緩沖液，制成10%和20%溶液，用這2種稀釋液對(duì)SEE進(jìn)行稀釋?zhuān)@得含有不同濃度SEE的火腿腸模擬樣本。

1.6 AlphaLISA實(shí)驗(yàn)步驟

將5 mg/mL的受體微球和1 mg/mL的生物素標(biāo)記抗體按照一定比例稀釋并混合，體積為20 μL，加入 5 μL不同濃度的 SEE 抗原，37℃孵育15 min，加入25 μL按一定比例稀釋的鏈霉親和素偶聯(lián)供體微球（原濃度為5 mg/mL），37℃孵育10 min，用SPECTRAMAX i3（MD）讀取信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化

AlphaLISA方法需要偶聯(lián)了羊抗腸毒的受體微球、生物素化的SEE小鼠單克隆抗體和親和素化的供體微球共3種組分。每種組分不同的使用比，可以對(duì)信號(hào)值造成較大的差異，所以首先摸索微球各組分使用的稀釋比例。

通過(guò)比較不同比例下信號(hào)值和背景值的比，即信噪比，結(jié)果見(jiàn)圖1，供體微球的稀釋比為1∶125、生物素化的SEE小鼠單克隆抗體的稀釋比為1∶2000、受體微球的稀釋比為 1∶100時(shí)，信噪比最大，為AlphaLISA反應(yīng)體系的最適條件。

圖1 各組分稀釋比例的優(yōu)化

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對(duì)AlphaLISA方法重復(fù)性的驗(yàn)證，選取了100和0 ng/mL濃度的SEE檢測(cè)信號(hào)。將同一次制備的抗體偶聯(lián)受體微球的12個(gè)重復(fù)的信號(hào)值作為批內(nèi)差，分3次制備的抗體偶聯(lián)受體微球的4個(gè)重復(fù)的信號(hào)值作為批間差。結(jié)果顯示，AlphaLISA檢測(cè)SEE的批內(nèi)差和批間差均小于10%（表1）。這意味著該方法具有良好的重復(fù)性，其重要原因在于AlphaLISA是一種均相免洗、操作步驟相對(duì)較少的方法。

表1 AlphaLISA檢測(cè)SEE的批間差和批內(nèi)差

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

對(duì)SEE敏感性的檢測(cè)，將SEE抗原用緩沖液從400 ng/mL以1/4梯度稀釋至25 pg/mL，采用非線性回歸法建立AlphaLISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)限為100 pg/mL（圖2A），緩沖液中SEE檢測(cè)的線性范圍為100 pg/mL～50 ng/mL（圖2B）。

圖2 SEE檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）和線性范圍（B）

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

除SEE外，一些其他的金黃色葡萄球菌腸毒素如SEA、SEB、SEC、SED，以及易引起食物中毒的肉毒毒素（botulinum toxin，BTX）也包括在特異性評(píng)價(jià)中。結(jié)果表明，SEE與其他毒素均無(wú)交叉反應(yīng)（圖3）。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的AlphaLISA方法能夠靈敏、特異地檢測(cè)緩沖液中的SEE。

圖3 SEE檢測(cè)的特異性

2.5 模擬樣本實(shí)驗(yàn)

SEE也是能夠?qū)е率澄镏卸镜囊环N毒素。本實(shí)驗(yàn)選擇了牛奶、火腿腸和面包制備食品模擬樣本。由于還不清楚食品中過(guò)多的雜質(zhì)是否會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生影響，因此對(duì)火腿腸、牛奶和面包進(jìn)行了適量稀釋。采用了3個(gè)品牌的全脂牛奶（牛奶1、牛奶2、牛奶3），并用PBS按1∶1的比例進(jìn)行了稀釋。結(jié)果表明，無(wú)論稀釋與否，AlphaLISA均能檢測(cè)出100 pg/mL的SEE（圖4）。除此之外，我們發(fā)現(xiàn)牛奶3對(duì)SEE檢測(cè)的信號(hào)值有一定的封閉作用，因此SEE檢測(cè)牛奶樣本的預(yù)處理應(yīng)采用PBS進(jìn)行1∶1的稀釋。

火腿腸和夾心面包樣本也可檢出100 pg/mL的SEE（圖5）。制備模擬樣本時(shí)，40%的火腿腸和夾心面包樣本黏性較大，很難混合；稀釋到20%后可以用于檢測(cè)，但重復(fù)性不好，且在SEE高濃度時(shí)信號(hào)值會(huì)被壓低；當(dāng)溶液濃度低于20%時(shí)，批內(nèi)CV＜10%，信號(hào)值也較好。因此，為了獲得重復(fù)準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，用AlphaLISA方法檢測(cè)火腿腸和夾心面包等食品樣本時(shí)，須將其稀釋到10%再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同品牌牛奶中SEE的檢測(cè)

2.6 AlphaLISA對(duì)菌液上清液中SEE的檢測(cè)

選擇10株金黃色葡萄球菌分離株，對(duì)培養(yǎng)上清液中SEE的檢測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]，除產(chǎn)SEE菌株326E外，其余菌株均為產(chǎn)SEE陰性菌株。結(jié)果見(jiàn)圖6，AlphaLISA能夠成功地將326E與其他9個(gè)分離株進(jìn)行鑒別。

3 討論

AlphaLISA技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)，就在生物學(xué)領(lǐng)域有了較為廣泛的應(yīng)用[8-9]。對(duì)于SEE的檢測(cè)，相比于傳統(tǒng)的ELISA方法[10]，AlphaLISA操作更為便捷，均相免洗，用時(shí)短。ELISA檢測(cè)所需樣本體積至少為50 μL，而AlphaLISA則只需要5 μL即可。

圖5 火腿腸和夾心面包模擬樣本中SEE的檢測(cè)

圖6 不同菌株菌液上清的檢測(cè)

緩沖液中SEE檢測(cè)的線性范圍為100 pg/mL～50 ng/mL，檢測(cè)限為100 pg/mL，具有較高的靈敏度；與其他幾種毒素?zé)o交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。在食品模擬樣本檢測(cè)中，由于無(wú)法確定食品中復(fù)雜成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，對(duì)不同的食品模擬樣本進(jìn)行了稀釋處理。結(jié)果顯示，該方法對(duì)食品樣本的耐受性較高，對(duì)于不同的食品模擬樣本，檢測(cè)限均可達(dá)100 pg/mL。同時(shí)，在緩沖液和模擬樣品中的變異系數(shù)均小于10%，表現(xiàn)出了較好的重復(fù)性。除此之外，AlphaLISA方法也可以在金黃色葡萄球菌菌液上清中準(zhǔn)確地檢測(cè)出SEE。綜上結(jié)果表明，我們所建立的AlphaLISA檢測(cè)方法不僅適用于食品樣本中SEE的檢測(cè)，同時(shí)，在SEE含量較低的金黃色葡萄球菌污染的食物樣本中，也可以通過(guò)分離培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，對(duì)菌液上清中的SEE進(jìn)行檢測(cè)。