利用長距離PCR擴(kuò)增國內(nèi)腸道病毒流行株基因組方法的建立和評(píng)價(jià)

姜棋予，馮帆，柴燕濤，孫慧偉，貌盼勇,侯俊,伯曉晨

1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 a.臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，b.臨床研究管理中心，北京 100039

人類腸道病毒（human enterovirus，HEV）屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約7500 bp。嬰幼兒手足口?。╤andfoot and mouth disease，HFMD）主要由A型腸道病毒引起，包括柯薩奇病毒A16型（coxsackievirus A16，CV-A16）、2-8型、10型、12型、14型以及腸道病毒71型（enterovirus 71，EV-71）。CV-A16和EV-71作為主要致病因子，其死亡率在1～3歲兒童中最高[1-2]。手足口病是20世紀(jì)90年代末東亞區(qū)域新發(fā)的兒童高度傳染性疾病，構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。

基于流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，亞基因組C4是我國EV-71感染的主要菌株，但國內(nèi)研究甚少，因而對(duì)EV-71 C4亞型的毒力位點(diǎn)和毒力決定因素尚不明確[3]。國內(nèi)的腸道病毒疫苗研制目前處于世界前列，針對(duì)我國3種不同分型的滅活EV-71疫苗Ⅲ期臨床試驗(yàn)最近完成，對(duì)EV-71相關(guān)HFMD的保護(hù)率為95%[4-5]，但是目前還沒有可用于EV-71的疫苗或特異性抗病毒藥物。在公共數(shù)據(jù)庫中檢索得到的EV-71完整基因組序列信息只有約500條，而人流感病毒A型則有約4500條完整序列信息[6]。因此，腸道病毒的全基因組測(cè)序，以及通用易行且準(zhǔn)確高效的擴(kuò)增方法的探索和建立，將為公共數(shù)據(jù)庫提供更多的全基因組序列信息，也是將來對(duì)腸道病毒深入研究的墊腳石。

隨著二代測(cè)序技術(shù)越來越廣泛地用于病原學(xué)研究，測(cè)序模板的成功制備顯得尤為重要。在病原學(xué)檢測(cè)中，往往存在著病毒拷貝數(shù)較低或基因組不易提取等問題，由此對(duì)樣本前處理提出了更高的要求。因此，建立一種通用的腸道病毒高保真擴(kuò)增及二代測(cè)序方法尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

腸道病毒樣本由本實(shí)驗(yàn)室病毒庫保存，收集了2014年以來各地區(qū)出現(xiàn)的手足口病患兒咽拭子標(biāo)本。咽拭子標(biāo)本經(jīng)Vero細(xì)胞或RD細(xì)胞等接種，在產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變后收集病毒液，反復(fù)凍融后離心去除細(xì)胞碎片收獲病毒，于-80℃凍存?zhèn)溆肹7]。本研究所用的腸道病毒HEV-96、HEV-124、HEV-19、HEV-1376、HEV-102為 EV-71 C4亞型，HEV-81為CV-A16。

常規(guī)PCR儀（PEQLAB公司）；天能凝膠成像分析系統(tǒng)（天能科技有限公司）；UCD-300非接觸式全自動(dòng)超聲破碎儀（Biorupter公司）；Ion PGM二代測(cè)序儀（Life公司）；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo公司）。

1.2 引物設(shè)計(jì)

腸道病毒全基因序列收集自美國國立生物技術(shù)信息中心病毒庫（NCBI virus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/）。檢索關(guān)鍵詞為“Enterovirus 71”和“Coxsackievirus A16”，地理地區(qū)（Geographic region）限定為“China”，根據(jù)腸道病毒分型分別收集中國地區(qū)曾暴發(fā)流行的CV-A16、EV-71，病毒序列信息的上傳時(shí)間（Collect date）限定為近5年（2014-01-01至今）。共90條序列信息，GenBank號(hào)如下：JN864022，EU753407.2，GQ994988.1，HQ611148.1，KC954662，KF501389，EU864507.1，JX678875.1，JQ517316，F(xiàn)J606449.1，EU703814.1，JN052925.1，JN020147.1，HN053670，GQ994991.1，KJ746494，JX244185，F(xiàn)J607335.1，GQ279370.1，F(xiàn)J194965.1，EU753375， GU366191， HQ456308， KY612315，KU936131， KU936126， KY582572， KP289430，KP289425， KU936132， KU936121， KP289412，KU936130，KP289421，KU936120，HQ694982.1，MG773122，F(xiàn)J360544.1，MG773124，KP289413，KU936123， KU936125， KY315729， KX752783，KU936127， LC375764， KP289419， KU647000，MG214681， KU254598， KU254597， KU936124，KP289420， KP289423， KT345960， KP289422，KP289418， MG875331， KP289432， KP289429，KP289424， KU936122， MG773125， KP289431，KT345959， KU936128， KP289428， KP289427，KU936129， KU254595， KP289417， KU254596，MG773123，KX595292，KM215267，MH010200，MH010202， KX595293， KX595295， KX595291，KX595294， KP289426， KT428644， KT428649，KT428650， KT428648， KT428646， KP289416，KP289415，KP289411。

通過腸道病毒基因組序列比對(duì)，所有腸道病毒的5'非翻譯區(qū)（UTR）532～568 bp存在較為保守的序列，在此區(qū)域設(shè)計(jì)保守引物，從病毒cDNA的3'端擴(kuò)增腸道病毒基因約6.8 kb長片段，如圖1中擴(kuò)增子2所示。腸道病毒基因組前端不存在高保守區(qū)，采用多重簡并引物擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域如圖1擴(kuò)增子1所示。

圖1 腸道病毒引物擴(kuò)增示意圖

1.3 腸道病毒基因組RNA提取及cDNA合成

用 QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN 公司）提取腸道病毒RNA，在操作RNA時(shí)嚴(yán)格注意防止RNA酶的污染，在超凈臺(tái)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用SuperScript IV First-Strand Synthesis System試劑盒（Invitrogen公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行鉚釘引物的連接。

1.4 長距離PCR擴(kuò)增

用LongRange HotStart PCR Kit（KAPA公司）進(jìn)行長距離PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體積為100 μL，包含 5×緩沖液 20 μL、25 mmol/L MgCl28 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各 5 μL、酶 4 μL、模板8 μL、甘油 8 μL、水 40 μL。設(shè)置退火溫度為58℃，前25次循環(huán)延伸9 min，后10次循環(huán)延伸10 min，最終延伸10 min。

1.5 特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

以2種同型EV-71病毒HEV-96、HEV-102混合感染，或以EV-71病毒HEV-61與CV-A16病毒HEV-81混合感染情況分別模擬臨床混合病毒感染的情況。2種腸道病毒分別以1∶1、1∶2、1∶10混合，對(duì)該混合病毒進(jìn)行長距離PCR擴(kuò)增并進(jìn)行二代測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 生物信息學(xué)分析

用CLC Genomics Workbench軟件（QIAGEN公司）進(jìn)行測(cè)序原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控、格式轉(zhuǎn)換、拼接以及后續(xù)下游分析。序列拼接使用De Novo從頭拼接工具，設(shè)置錯(cuò)配罰分為2、插入與缺失罰分為3、片段相似度為0.8，得到的序列大片段contig進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)

如表1，3'端polyA尾逆轉(zhuǎn)錄錨定引物為P3UT；擴(kuò)增子2的正向引物為P3U-5，反向引物為P3U-T2；擴(kuò)增子1的正向引物為5U-F-1，反向引物為5U-R。

表1 腸道病毒擴(kuò)增引物

2.2 腸道病毒全基因組擴(kuò)增

對(duì)4株EV-71型腸道病毒逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行長距離PCR擴(kuò)增，各泳道可見約7000 bp的條帶（圖2A）。腸道病毒5'UTR序列擴(kuò)增均得到特異性產(chǎn)物，長度約550 bp（圖2B）。以上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序驗(yàn)證，均得到了約1000倍的覆蓋度，contig拼接如圖2C所示。

圖2 腸道病毒全基因組擴(kuò)增及驗(yàn)證結(jié)果

2.3 特異性檢測(cè)

已知 HEV-96、HEV-102、HEV-61為 EV-71型，HEV-81為CV-A16型。以不同比例混合同型腸道病毒，長距離PCR擴(kuò)增和簡并引物擴(kuò)增全基因組序列，二代測(cè)序獲得的測(cè)序reads數(shù)如圖3A；將EV-71與CV-A16不同型腸道病毒以不同比例混合后擴(kuò)增并測(cè)序，獲得的測(cè)序reads數(shù)如圖3B。結(jié)果表明，測(cè)序獲得的reads數(shù)比例與混合時(shí)比例大致相同。在已知的GQ994991.1和GU196833.1重組腸道病毒中[7]，利用該方法擴(kuò)增獲得全基因組序列，通過序列mapping比對(duì)能夠正確反映重組腸道病毒情況，圖3C顯示了重組腸道病毒的參考序列比對(duì)情況。

3 討論

近幾年乃至幾十年間，腸道病毒一直在我國和亞洲范圍內(nèi)持續(xù)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和負(fù)擔(dān)。我國手足口病的暴發(fā)流行主要在每年的5月和10月，導(dǎo)致疾病的病原體主要是腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型[8-10]。在近幾年的腸道病毒流行株中，EV-71 C4亞型占相當(dāng)高的比例[11]。在腸道病毒實(shí)驗(yàn)室診斷中，我們只能得知是否腸道病毒感染以及病毒含量，無法獲得腸道病毒的全基因組序列。但是在流行病學(xué)以及分子生物學(xué)研究中，腸道病毒基因組序列非常重要，通過全基因組序列的生物信息學(xué)分析，可以對(duì)特定嚴(yán)重病例進(jìn)行深入的機(jī)制研究，也可以斷定暴發(fā)流行的程度[12]。利用二代測(cè)序的腸道病毒全基因組研究更可以區(qū)分腸道病毒不同分型的混合感染，得到更準(zhǔn)確的腸道病毒流行株序列信息，為繪制高分辨率的病毒譜提供了便利[13]。

腸道病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，這導(dǎo)致了自身核酸的不穩(wěn)定性，對(duì)腸道病毒全基因組的準(zhǔn)確擴(kuò)增造成了諸多困難，主要體現(xiàn)在：在傳統(tǒng)的分段設(shè)計(jì)引物時(shí)，腸道病毒可能在引物的設(shè)計(jì)位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致引入突變或引物失效；混合腸道病毒感染情況時(shí)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)含有核酸多態(tài)性，特異性引物可能導(dǎo)致混合病毒序列信息的丟失；針對(duì)每一株腸道病毒或一批流行株腸道病毒進(jìn)行引物設(shè)計(jì)與合成不僅耗費(fèi)了人力物力，也對(duì)試劑和成本造成浪費(fèi)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列通用擴(kuò)增引物，能夠涵蓋近年來國內(nèi)暴發(fā)的腸道病毒流行株，獲得全基因組序列。

圖3 腸道病毒全基因組擴(kuò)增特異性評(píng)價(jià)

在腸道病毒暴發(fā)流行中，EV-71型和CV-A16型為主要出現(xiàn)的病原體，這2種病原體在每年大流行中共同交替與進(jìn)化[14-15]，在臨床診斷和深入研究中，出現(xiàn)了患者混合腸道病毒感染的情況以及腸道病毒重組感染的情況。我們分別對(duì)這2種臨床可能出現(xiàn)的情況進(jìn)行了模擬與驗(yàn)證，結(jié)果顯示我們建立的方法具有分辨混合病毒感染的能力，且通過二代測(cè)序的序列讀數(shù)數(shù)量可大概推算2種混合腸道病毒的比例；重組腸道病毒的全序列擴(kuò)增也同樣能夠得到真實(shí)反映。

我國每年暴發(fā)的腸道病毒流行株可能不盡相同，若每年根據(jù)腸道病毒流行株的分型信息設(shè)計(jì)特異性引物，將消耗很大的人力物力，并造成試劑和經(jīng)濟(jì)的浪費(fèi)。我們通過將建立的腸道病毒全基因組序列擴(kuò)增方法與二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，節(jié)省了連接載體后測(cè)序等一系列步驟，節(jié)約了科研時(shí)間，也為進(jìn)一步的生物信息學(xué)研究提供了準(zhǔn)確、足量的數(shù)據(jù)。