GATA1通過上調(diào)NANOG促進(jìn)胰腺癌腫瘤干細(xì)胞形成

常振宇，張亞楠，劉婕，丁麗華，劉榮

1.解放軍總醫(yī)院 肝膽外二科，北京 100853；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100850

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，90%以上為胰腺導(dǎo)管腺癌，其早期診斷困難，進(jìn)展較快，生存期短，死亡率高[1]。據(jù)2015年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，胰腺癌死亡率位居所有惡性腫瘤的第6位[2]。

胰腺癌具有侵襲性高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和高度耐藥的特點(diǎn)，其中腫瘤干細(xì)胞是造成這種現(xiàn)象的一個重要原因[3]。腫瘤干細(xì)胞是具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞亞群，具有自我更新和多向分化能力，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[4]。腫瘤干細(xì)胞有其特異的表面標(biāo)志物；研究表明，胰腺癌中具有CD133+或CD44+/CD24+/EpCAM+標(biāo)志的細(xì)胞有干細(xì)胞特性[5]。

腫瘤干細(xì)胞的形成與維持依賴于干性基因的調(diào)控，如OCT4、SOX2、NANOG 等[6]。NANOG基因最早發(fā)現(xiàn)于胚胎干細(xì)胞中，編碼一種同源域轉(zhuǎn)錄因子，對維持干細(xì)胞的自我更新和分化能力起著關(guān)鍵作用[7]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)NANOG基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要功能。在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲低NANOG表達(dá)會明顯減弱細(xì)胞的成球能力、降低腫瘤干細(xì)胞的含量、抑制腫瘤的生長[8]；而在宮頸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中，NANOG/Tcl1a/Akt信號通路的激活會增加腫瘤干細(xì)胞的含量，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[9]。目前NANOG在胰腺癌中的作用相關(guān)研究較少，具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

GATA1是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在紅系細(xì)胞分化過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[10]。GATA1既往被認(rèn)為是造血系統(tǒng)特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，但近期研究表明GATA1在實(shí)體腫瘤中也扮演著重要角色。在乳腺癌中，GATA1通過激活PAK5導(dǎo)致細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，GATA1可以通過調(diào)控Bcl-XL誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥[12]。但GATA1與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系尚未見相關(guān)研究報道。

本研究中，我們通過構(gòu)建GATA1過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)GATA1在調(diào)控胰腺癌腫瘤干細(xì)胞中的作用，進(jìn)一步對其下游干性基因進(jìn)行了篩選，并深入探究了其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞PANC-1、SW1990購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；人胚胎腎細(xì)胞 293T，質(zhì)粒 pCDH-GATA1-GFP、pcDNA-Flag-GATA1、pGL4.0、pRL-TK為本室保存；慢病毒包裝系統(tǒng)pPack Packaging Plasmid Mix購于SBI公司；DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；PCR擴(kuò)增酶Pfu、反轉(zhuǎn)錄酶MMLV、qPCR試劑TB Green Premix購于TaKa-Ra公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶購于NEB公司；兔抗人CD133偶聯(lián)PE流式抗體購于eBioscience公司；兔抗人NANOG抗體購于Proteintech公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)Flag抗體、β-actin抗體購于Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Megatran購于Origene公司；轉(zhuǎn)染試劑Vigofect、雙熒光素酶報告基因試劑盒購于Vigorous公司；染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購于Millipore公司；引物合成及測序由北京博邁德公司完成。

1.2 慢病毒包裝及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株獲取

接種293T細(xì)胞于6 cm皿中，密度達(dá)到40%～60%為宜；取病毒包裝質(zhì)粒 pLP1 1.68 μg、pLP2 0.8 μg、pVSVG 1.12 μg及目的質(zhì)粒 2 μg，加入無血清無雙抗的DMEM稀釋至400 μL，充分混勻后加入Megatran試劑20 μL，振蕩混勻后室溫靜置10 min，逐滴加入培養(yǎng)液中，48～72 h后收取病毒上清。將PANC-1細(xì)胞接種于6 cm皿中，密度達(dá)到50%～70%為宜；取2 mL病毒上清液加入PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)液中，48 h后換正常培養(yǎng)基；72 h后流式細(xì)胞分選GFP綠色熒光陽性的細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.3 流式細(xì)胞檢測

將PANC-1細(xì)胞和PANC-1-GATA1-GFP細(xì)胞接種于6孔板，密度為40%～60%，24 h后將細(xì)胞消化、重懸、離心，1×PBS洗2次后加入80 μL含3%牛血清的PBS重懸，各組細(xì)胞分別加入對照PE 染料和 CD133-PE抗體 10 μL，4℃避光反應(yīng)30 min，3000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用含3%牛血清的PBS洗2次后，加入400 μL含3%牛血清的PBS重懸，上機(jī)檢測。

1.3 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染

接種PANC-1細(xì)胞或SW1990細(xì)胞于6孔板，密度50%～70%為宜；吸取轉(zhuǎn)染試劑Vigofect 2 μL，用生理鹽水稀釋至100 μL，混勻后室溫靜置5 min；取質(zhì)粒3 μg，用生理鹽水稀釋至100 μL，與稀釋后的Vigofect混勻，室溫靜置15 min；將得到的工作液逐滴加入培養(yǎng)基中，4～6 h后換液，24～48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR

棄去培養(yǎng)基后用1×PBS清洗，加入1 mL PBS刮取細(xì)胞，3000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，TRIzol裂解細(xì)胞，氯仿分層，異丙醇沉淀，乙醇清洗，干燥后DEPC處理水溶解，得到總RNA，測定濃度及純度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系包括RNA 2 μg、oligo（dT）1 μL，加水 至 15.9 μL，70℃反應(yīng)5 min，立刻置于冰上，加入MMLV 1 μL、5×MMLV 緩沖液 5 μL、dNTP 2.5 μL，RNase抑制劑0.6 μL，充分混勻，42℃反轉(zhuǎn)錄 1 h，95℃5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA第一鏈，稀釋至100 μL。實(shí)時熒光定量PCR體系為TB Green Premix 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 模板9.2 μL；每組設(shè)置3個重復(fù)孔，β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。qPCR引物序列見表1。

表1 qPCR引物

1.5 Western印跡檢測NANOG表達(dá)

收取對照及GATA1過表達(dá)細(xì)胞，用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上反應(yīng)30 min后加入等體積2×SDS上樣緩沖液，沸水中變性15 min，12 000 r/min離心1 min，上樣進(jìn)行SDS-PAGE，蛋白樣品充分分離后，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，TBST配制5%的脫脂奶粉封閉30 min，孵育兔抗人NANOG抗體（Flag抗體及β-actin抗體同時孵育，4℃孵育過夜），TBST洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.6 pGL4-NANOG promotor-Luciferase重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在UCSC Genome Brower網(wǎng)站查詢NANOG基因啟動子-1000～+50 bp序列，設(shè)計(jì)上游引物（5'-GGGGTACCAGACATGACAAATCACCAGAC-3'，酶切位點(diǎn)為KpnⅠ）和下游引物（5'-CCCAAGCTT GGCTCTATCACCTTAGACCCAC-3'，酶 切 位 點(diǎn) 為HindⅢ），以人胰腺癌細(xì)胞PANC-1基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增釣取啟動子片段，反應(yīng)體系包括上下游引物各1 μL、Pfu0.5 μL、10×緩沖液5 μL、dNTP 1 μL、模板 1 μL，補(bǔ)水至 50 μL。回收擴(kuò)增片段，與pGL4載體分別經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ雙酶切過夜，回收酶切載體與片段，用T4DNA連接酶連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定（上游引物為5'-GACATGACAAATCACCAG AC-3'，下游引物為5'-GGCTCTATCACCTTAGAC CCAC-3'），選取陽性克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送公司測序。

1.7 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

接種PANC-1和SW1990細(xì)胞于24孔板，轉(zhuǎn)染前密度達(dá)到50%～70%，將空載體或pcDNA-Flag-GATA1與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24～48 h后收取細(xì)胞，按試劑盒操作指南裂解細(xì)胞，依次測定螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性，海腎螢光素酶活性作為內(nèi)參，計(jì)算相對活性值。

1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）

PANC-1細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后加入新鮮配置的1%甲醛溶液固定10 min，刮取細(xì)胞后3000 r/min離心5 min，棄上清，按試劑盒說明書依次裂解細(xì)胞、核裂解、超聲破碎、稀釋、加入磁珠，在所得樣品中加入GATA1抗體或?qū)φ誌gG，4℃結(jié)合過夜，依次進(jìn)行清洗、洗脫、純化得到DNA片段，以所得DNA片段為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，所用引物序列見表2。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 23.0；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中連續(xù)變量均以x±s表示，2組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 ChIP qPCR引物

2 結(jié)果

2.1 GATA1過表達(dá)細(xì)胞株中腫瘤干細(xì)胞含量增加

我們構(gòu)建了GATA1過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用流式細(xì)胞術(shù)檢測了對照及GATA1過表達(dá)細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的含量，發(fā)現(xiàn)GATA1過表達(dá)細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞比例明顯增加（圖1）。CD133是胰腺癌腫瘤干細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志物，這說明在GATA1過表達(dá)細(xì)胞株中胰腺癌干細(xì)胞含量增加。

圖1 對照及GATA1過表達(dá)細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的比例

2.2 GATA1下游干性基因的篩選

采用實(shí)時定量PCR檢測了對照及GATA1過表達(dá)PANC-1細(xì)胞中干性基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖2，瞬時轉(zhuǎn)染GATA1之后，NANOG、BMI-1和C-MYC的mRNA水平上調(diào)，其中NANOG的上調(diào)幅度較大，說明NANOG可能是GATA1直接調(diào)控的下游干性基因。

圖2 GATA1下游干性基因的篩選

2.3 GATA1上調(diào)NANOG的mRNA和蛋白表達(dá)

基于以上結(jié)果，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了GATA1對NANOG蛋白表達(dá)水平的影響。在PANC-1和SW1990細(xì)胞中過表達(dá)GATA1后，qPCR檢測NANOG mRNA表達(dá)，Western印跡檢測NANOG蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示NANOG過表達(dá)細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)水平都相應(yīng)上調(diào)（圖3）。

2.4 pGL4-NANOG promotor-Luciferase重組質(zhì)粒鑒定

GATA1作為轉(zhuǎn)錄因子，主要通過結(jié)合在下游基因的啟動子上發(fā)揮作用。因此，我們從胰腺癌基因組中釣取了NANOG啟動子-938～-3 bp片段（圖4A），并構(gòu)建至螢光素酶報告基因，PCR鑒定和雙酶切鑒定可見片段大小正確（圖4A），測序比對發(fā)現(xiàn)序列正確（圖4B），說明pGL4-NANOG promotor-Luciferase重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.5 GATA1增強(qiáng)NANOG啟動子的活性

將空載體或GATA1過表達(dá)載體與構(gòu)建的螢光素酶報告基因共同轉(zhuǎn)染PANC-1和SW1990細(xì)胞，測定雙螢光素酶活性，結(jié)果見圖5，GATA1過表達(dá)組NANOG啟動子的活性明顯高于對照組，說明GATA1結(jié)合在NANOG啟動子上調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。

2.6 GATA1結(jié)合在NANOG啟動子-527～-524 bp的GATA序列

為探究GATA1在NANOG啟動子上具體的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)GATA1結(jié)合DNA的序列特點(diǎn)，預(yù)測出A、B、C、D等4個可能的結(jié)合位點(diǎn)（圖6A），并針對這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果（圖6B）顯示，GATA1主要募集在NANOG啟動子的B位點(diǎn)，在A、C、D位點(diǎn)均無募集，說明GATA1結(jié)合在NANOG啟動子的B位點(diǎn)，即-527～-524 bp處的GATA序列上。

圖3 GATA1上調(diào)NANOG的mRNA和蛋白表達(dá)

圖4 pGL4-NANOG promotor-Luciferase重組質(zhì)粒鑒定

圖5 GATA1增強(qiáng)NANOG啟動子活性

圖6 GATA1在NANOG啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)鑒定

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中比例較低的一個亞群，在腫瘤的發(fā)生、耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著主要作用[4]。腫瘤干細(xì)胞的存在最初發(fā)現(xiàn)于急性髓性白血病中[13-14]，在實(shí)體腫瘤中首先在乳腺癌中被證實(shí)。2003年Al-Hajj等報道乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，在裸鼠體內(nèi)具有極強(qiáng)的腫瘤形成能力[15]；后續(xù)相關(guān)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)瘤、前列腺癌、卵巢癌中的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[16-18]。2007年，Li等和Hermann等首次確定了胰腺癌中腫瘤干細(xì)胞的存在，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞亞群具有干細(xì)胞特性[19-20]；近年有研究報道CXCR、c-MET、ALDH1等也是胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[21]。我們通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)GATA1過表達(dá)的胰腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞比例升高，這說明GATA1過表達(dá)可以增加胰腺癌細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的含量。

腫瘤干細(xì)胞的形成和維持過程涉及多個通路，如Notch 通路、Hedgehog通路、Wnt通路等[22]；其中多個基因發(fā)揮著重要功能，如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-MYC等[4]。NANOG基因是維持胚胎干細(xì)胞的多能分化性的關(guān)鍵基因，在正常的體細(xì)胞中表達(dá)量很低，但在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[23]。目前多項(xiàng)研究表明NANOG表達(dá)水平的上調(diào)與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時NANOG的表達(dá)水平與多種腫瘤病人的預(yù)后相關(guān)[24]。腫瘤中NANOG的表達(dá)水平受到多種分子的調(diào)控，在肝癌細(xì)胞中磷酸化的STAT3可以上調(diào)NANOG的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長[25]；在膠質(zhì)瘤中，Hedgehog-Gli通路可以通過調(diào)控NANOG的表達(dá)影響腫瘤干細(xì)胞的含量[26]。目前，在胰腺癌中NANOG的調(diào)控機(jī)制研究較少。在本研究中，我們通過實(shí)時熒光定量PCR檢測了GATA1過表達(dá)細(xì)胞中干性基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NANOG的水平明顯上調(diào)，又進(jìn)一步從蛋白水平進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示GATA1可以上調(diào)NANOG的表達(dá)。

GATA1轉(zhuǎn)錄因子包含2個鋅指結(jié)構(gòu)，C端鋅指結(jié)構(gòu)可以結(jié)合GATA序列，N端鋅指可以結(jié)合GATC序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[27]。我們構(gòu)建了包含NANOG啟動子的螢光素酶報告基因，發(fā)現(xiàn)GATA1可以促進(jìn)NANOG啟動子的活性；我們針對啟動子序列上的GATA和GATC位點(diǎn)設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物，通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了GATA1結(jié)合在NANOG啟動子-527～-524 bp的GATA序列上。

本研究結(jié)果說明GATA1可以上調(diào)胰腺癌中腫瘤干細(xì)胞的含量，同時GATA1可以通過結(jié)合在NANOG啟動子上促進(jìn)其表達(dá)。結(jié)合既往研究報道中的結(jié)果——敲低NANOG抑制胰腺癌干細(xì)胞的干性[28]，推論GATA1可以通過NANOG調(diào)控胰腺癌腫瘤干細(xì)胞的含量，但仍須進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了GATA1在調(diào)控胰腺癌腫瘤干細(xì)胞中的功能，并且明確了GATA1調(diào)控干性基因NANOG的具體機(jī)制，為探討胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的證據(jù)，為尋找新的有效治療靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。