乙型肝炎相關性肝癌血清標志物診斷價值及支持向量機鑒別診斷模型的建立*

白 晶 劉海順 萬鴻飛 劉向祎*

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均居世界惡性腫瘤的前列[1-2]。我國HCC病死率占惡性腫瘤的18.8%，其5年生存率僅為5%～9%[3-4]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是HCC的主要因素，我國以HBV感染引起的HBV相關性肝癌最為常見，約有40%的HBV感染患者會發(fā)展成為肝硬化和HCC，原發(fā)性肝癌中乙型肝炎相關肝癌占90%[5-6]。臨床中早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療是有效控制乙型肝炎相關HCC的關鍵，但影像和病理檢查所需費用很高，不能對高危人群進行很好的監(jiān)測，因此高靈敏度和特異度的腫瘤標志物對識別HCC非常必要，迫切需要更精確、更有效的生物標志物。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)對HCC診斷的其靈敏度為40%～65%，當肝癌病灶很小，AFP檢測的假陰性率較高[7]。脫-γ-羧基凝血酶原(des-γcarboxy-prothrombin，DCP)又稱維生素K缺乏或拮抗誘導的異常蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)， HCC合成的無凝血活性的異常凝血酶原，是判斷HCC進展程度與預后的重要指標。AFP、DCP作為常規(guī)血清腫瘤標志物，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性，并且缺乏足夠的敏感性及特異性[8]。高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是肝臟膽管上皮細胞表達的特異性膜蛋白，在HBV和HCV感染相關的HCC患者血清中濃度顯著升高，但GP73診斷HCC的效能以及GP73在良、惡性肝病中的表達高低存在爭議，GP73對HCC的診斷價值并不優(yōu)于AFP[9]。基于此，本研究通過檢測AFP、GP73及DCP在HBV相關性HCC患者血清中的表達水平，探討聯(lián)合檢測上述指標在HBV相關性HCC中的診斷價值，為HBV相關性HCC的篩查與診斷提供參考依據(jù)。

本研究創(chuàng)新性在于通過運用支持向量機(support vector machine，SVM)數(shù)學模型，建立HBV相關性HCC篩查診斷模型，以提高分類的正確率，為HBV相關性HCC的早期診斷提供新的方法和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月至2018年1月就診于首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院的177例HBV患者，其中男性93例，女性84例；年齡19～70歲，平均年齡(50.6±11.7)歲。根據(jù)患者疾病情況將其分為HBV相關性HCC組(57例)、HBV相關性肝硬化組(52例)及慢性乙型肝炎組(68例)；同期選擇74名健康體檢者將其納入健康對照組，其中男性35名，女性39名；年齡20～65歲，平均年齡(45.22±10.09)歲。分別檢測4組受試者的血清DCP、AFP及GP73水平。4組基本資料的比較無差異，具有可比性。所有受試者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準

(1)HBV相關性HCC組:①符合國家原衛(wèi)生和計劃生育委員會醫(yī)改醫(yī)管局《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[10](2017年版)，經(jīng)臨床表現(xiàn)、病理結果、影像學等其他相關檢查綜合診斷為原發(fā)性肝癌者；②存在慢性HBV感染者；③均未行手術、射頻消融、介入、放化療等抗腫瘤行為者。

(2)HBV相關性肝硬化組:符合中華醫(yī)學會肝病學分會《慢性乙型肝炎防治指南》[11](2015年更新版)，臨床表現(xiàn)、生化、組織病理學檢查或肝臟超聲等影像學檢查綜合診斷為肝硬化者。

(3)慢性乙型肝炎組:符合中華醫(yī)學會肝病學分會2015年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》[11](2015年更新版)，慢性乙型肝炎診斷標準，但肝組織病理學檢查或癥狀、體征、化驗及影像學檢查無肝硬化證據(jù)者。

(4)健康對照組:年齡≥18周歲，體檢未發(fā)現(xiàn)明顯疾病者。

1.2.2 排除標準

排除標準:①曾服用維生素K制劑或維生素K拮抗劑如雙香豆素、華法林等藥物者；②合并其他臟器原發(fā)惡性腫瘤者或轉(zhuǎn)移性肝癌者；③存在HCV等其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病、藥物性肝損害、遺傳代謝性疾病、肝血吸蟲病等其他原因引起的肝臟損害者；④妊娠期或哺乳期婦女等情況。

1.3 樣本采集

所有受試者于清晨空腹禁水狀態(tài)下用一次性采血器抽取肘靜脈血約3～5 m1，置入帶分離膠的真空采血管，室溫靜止30 min，以3500 r／min離心15 min，分離血清用于腫瘤標志物檢測；取上清至2 ml的Eppendorf管中，置入-80 ℃保存?zhèn)溆?，樣本注意避免污染和反復凍融?/p>

1.4 儀器與試劑

采用Cobas e601型電化學發(fā)光分析儀(瑞士羅氏公司)；肝癌血清學標志物AFP、DCP和GP73均采用電化學發(fā)光方法檢測，AFP采用羅氏試劑，DCP、GP73采用北京熱景生物技術有限公司試劑。

1.5 SVM模型的建立

鑒于ROC曲線對HBV相關性HCC組、乙型肝炎組和HBV相關性肝硬化組分類的正確率不是很高，本研究采用SVM數(shù)學模型進行有效的分類，選取較為常用的徑向基核函數(shù)其計算為公式1:

式中γ為核參數(shù)，在尋求最優(yōu)超平面時會用到懲罰參數(shù)C，2個參數(shù)均為待優(yōu)化參數(shù)，決定了模型的效能及泛化能力[12]。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差(x-±s)表示，非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(Q25，Q75)表示，計數(shù)資料用率(%)表示。多個樣本均數(shù)的比較先進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，對于符合上述條件者，采用方差分析進行比較，反之采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis H test)比較，組間兩兩比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney U test)；繪制受試者工作特征 (receiver operator characteristic，ROC)曲線，確定最佳臨界值，采用Z檢驗比較各指標ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)的差異，按α=0.05為檢驗水準，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清DCP、GP73和AFP水平的比較

將各指標數(shù)據(jù)取對數(shù)，通過Shapiro-Wilk正態(tài)檢驗，DCP與AFP不滿足正態(tài)分布，故對于DCP、GP73及AFP的含量，各組間采用Kruskal-Wallis H檢驗(H=104.27，H=79.45，H=45.681；P＜0.001)，兩兩組間采用Mann-Whitney U檢驗；而GP73的檢測數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，組間采用t檢驗，見表1。

(1)血清DCP水平:健康對照組與乙型肝炎組、HBV相關性肝硬化組及HBV相關性HCC組的DCP含量差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(U=174.5，U=245，U=304.5；P＜0.05)；乙型肝炎組與HBV相關性HCC組的DCP含量差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(U=210.5，P＜0.05)；HBV相關性肝硬化組與HBV相關性HCC組的DCP含量差異無統(tǒng)計學意義(U=255，P＞0.399)。

(2)血清GP73水平:健康對照組與HBV相關性肝硬化組、HBV相關性組HCC的GP73比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=-14.579，t=-12.007；P＜0.05)；乙型肝炎組與HBV相關性肝硬化組、HBV相關性HCC組GP73含量有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義(t=-6.847，t=-6.524；P＜0.001)；HBV相關性肝硬化組與HBV相關性HCC組的GP73含量差異無統(tǒng)計學意義(t=0.776，P＞0.05)。

(3)血清AFP水平；健康對照組與HBV相關性肝硬化組、HBV相關性HCC組的AFP含量有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義(U=189.5，U=345；P＜0.05)；乙型肝炎組與HBV相關性肝硬化組、HBV相關性HCC組的AFP含量有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義(U=163，U=177；P＜0.05)；HBV相關性肝硬化組與HBV相關性HCC組的AFP含量差異無統(tǒng)計學意義(U=273， P＞0.629)。

2.2 血清DCP、GP73及AFP聯(lián)合檢測對HBV相關性HCC診斷價值

(1)HBV相關性HCC組與健康對照組組血清DCP、GP73及AFP含量的ROC曲線以及各項指標的曲線下面積(AUC)和95%置信區(qū)間見圖1。

圖1顯示:①AUCDCP=0.848，95%CI(0.741～0.955)，最佳臨界值為6.705 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為77.8%、97.3%、91.3%和92.3%；②AUCGP73=0.984，95%CI(0.965～1.000)，最佳臨界值為92.6 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.6%、95.9%、89.3%和97.3%；③AUCAFP=0.827，95%CI(0.728～0.927)，以20 ng/ml為標準時，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%、89.2%、69.2%和88%。對3項指標進行Logistic回歸分析獲得聯(lián)合預測因子，繪制3項指標聯(lián)合診斷的ROC曲線，得出AUCDCP+GP73+AFP=0.997，95%CI(0.4930～1.000)，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為98.9%、98.6%、96.4%和98.6%。3項指標聯(lián)合診斷要好于單獨診斷，其差異有統(tǒng)計學意義(U=11.2，P＜0.001)。

表1 血清DCP、AFP及GP73檢測結果(M Q25,Q75)

圖1 HBV相關性HCC組與健康對照組DCP、GP73及AFP含量的ROC曲線

(2)HBV相關性HCC組與HBV相關性肝硬化組血清DCP、GP73及AFP含量分別繪制3項指標診斷HBV相關性肝癌的ROC曲線，得出各項指標的AUC及95%置信區(qū)間，見圖2。

圖2 HBV相關性HCC組與HBV相關性肝硬化組DCP、GP73及AFP含量的ROC曲線

圖2 顯示:①AUCDCP=0.57，95%CI(0.403～0.739)，最佳臨界值為11.219 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為70.4%、59.1%、67.9%和61.9%；②AUCGP73=0.459，95%CI(0.294～0.623)，最佳臨界值為168.208 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為51.9%、59.1%、60.9%和50%；③AUCAFP=0.540，95%CI(0.374～0.707)，以20 ng/ml為標準時，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為48.1%、77.3%、72.2%和54.8%。對3項指標進行Logistic回歸分析獲得聯(lián)合預測因子，繪制3項指標聯(lián)合診斷的ROC曲線，得出AUCDCP+GP73+AFP=0.650，95%CI(0.493～0.807)，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%、68.2%、72%和62.5%，3項指標聯(lián)合診斷要好于單獨診斷，其差異有統(tǒng)計學意義(U=9.8，P＜0.001)。但聯(lián)合診斷仍不能很好地區(qū)分HBV相關性HCC與HBV相關性肝硬化。

(3)HBV相關性HCC組與乙型肝炎組血清DCP、GP73及AFP含量分別繪制3項指標診斷HBV相關性肝癌的ROC曲線，得出各項指標的AUC及95%置信區(qū)間，見圖3。

圖3 HBV相關性HCC 組與乙型肝炎組DCP、GP73及AFP含量的ROC曲線

圖3 顯示:①AUCDCP=0.711，95%CI(0.556～0.867)，最佳臨界值為13.952 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%、88.9%、68.1%和72.7%；②AUCGP73=0.919，95%CI(0.846～0.992)，最佳臨界值為84.792ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.6%、81.5%、83.3%和91.7%；③AUCAFP=0.757，95%CI(0.625～0.890)，最佳臨界值為0.575 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為88.9%、64.3%、68.6%和84.2%。對3項指標進行Logistic回歸分析獲得聯(lián)合預測因子，繪制3項指標聯(lián)合診斷的ROC曲線，得出AUCDCP+GP73+AFP=0.919，95%CI(0.846～0.992)，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為97.5%、74.1%、79.4%和98.6%，3項指標聯(lián)合診斷要好于單獨診斷，其差異有統(tǒng)計學意義(U=16.2，P＜0.001)。

(4)HBV相關性HCC組與乙型肝炎組+HBV相關性肝硬化組患者血清DCP、GP73及AFP含量分別繪制3項指標診斷HBV相關性肝癌的ROC曲線，得出各項指標的AUC及95%置信區(qū)間，見圖4。

表2 SVM模型建立及效果評價(%)

圖4 HBV相關性HCC 組與乙型肝炎組+HBV相關性肝硬化組DCP、GP73及AFP含量的ROC曲線

圖4 顯示:①AUCDCP=0.648，95%CI(0.502～0.794)，最佳臨界值為13.951 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%、75.5%、60%和80.4%；②AUCGP73=0.712，95%CI(0.598～0.827)，最佳臨界值為84.792 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.6%、46.9%、49%和92%；③AUCAFP=0.660， 95%CI(0.535～0.785)，最佳臨界值為0.383 ng/ml，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為98.5%、46.5%、42.9%和99.7%。對3項指標進行Logistic回歸分析獲得聯(lián)合預測因子，繪制3項指標聯(lián)合診斷的ROC曲線，得出AUCDCP+GP73+AFP=0.728，95%CI(0.615～0.814)， 其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為98.2%、52.8%、47.4%和97.6%；3項指標聯(lián)合診斷要好于單獨診斷，其差異有統(tǒng)計學意義(U=17.2，P＜0.001)；但單獨和聯(lián)合診斷其特異性和陽性預測率均不高。

2.3 SVM模型效果評價

采用網(wǎng)格搜尋結合5折交叉驗證的方法確定SVM數(shù)學模型γ和C的2個參數(shù)。SVM在對于HBV相關性HCC組與HBV相關性肝硬化組、乙型肝炎組和健康對照組具有較好的診斷效果，在診斷中HBV相關性HCC組與健康對照組的特異度和敏感度均達到了100%；診斷HBV相關性HCC與HBV相關性肝硬化時，特異度和靈敏度達到了90.91%和96.3%(見表2)。

3 討論

HBV感染是我國肝癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，肝癌的5年生存率為40%，早期行肝癌切除術可將生存率提升至60～70%[13]。病理學活檢是診斷肝癌的金標準，但因其為侵入性檢查，存在穿刺的難度及風險。影像學檢查對小肝細胞癌的檢出能力有限。血清學生物標志物具有無創(chuàng)性、簡便性、客觀性等特點，多用于肝癌的早期篩查與診斷以及肝癌的監(jiān)測管理。

AFP是應用最為廣泛的HCC血清學指標，每6個月進行血清AFP的檢測和腹部超聲的檢查已普遍成為肝癌高危人群的篩查辦法[14]。由于AFP在肝癌的篩查和診斷中存在靈敏度和特異度低的問題，近年歐洲肝臟研究學會和美國肝病研究學會在其更新的診療指南中不再將AFP作為肝癌的篩查與診斷標準[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關性HCC組患者血清AFP水平顯著高于健康對照組，最佳臨界值為6.705 ng/ml，此時的AUC=0.827，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%、89.2%、69.2%和88%，與文獻報道的研究結果相近[17]。本研究中AFP診斷靈敏度僅為66.7%，近40%的HCC患者可能被漏診，因此仍需警惕AFP陰性的高危人群發(fā)生HCC的風險。HBV相關性肝硬化組患者血清AFP也可以升高，與HBV相關性HCC組之間的差異無統(tǒng)計學意義，可能與納入樣本病例疾病程度有關，AFP的血清水平在不同病因引起的HCC中是否存在差異還需進一步探討。

DCP其對HCC的診斷價值已受到了國際上的肯定，日本已將血清DCP的檢測納入肝癌高危人群的篩查管理項目[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關性HCC組患者血清DCP水平高于健康對照組，且差異顯著，當最佳臨界值為6.705 nɡ/ml時，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為77.8%、97.3%、91.3%和92.3%，血清DCP診斷HBV相關性HCC的特異度較高，有助于HBV相關性HCC的篩查。同時，血清DCP的陰性預測值較高，對HCC的排除具有一定的臨床價值，與文獻相關報道一致[19]。

GP73在正常肝組織中，且主要在膽管上皮細胞內(nèi)表達，在HBV和HCV感染相關的HCC患者血清中濃度顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關性HCC患者血清GP73水平高于健康對照組，且差異顯著，當最佳臨界值為84.310 ng/ml時，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為92.6%、95.9%、89.3%和97.3%。而HBV相關性肝硬化組與HBV相關性HCC組相比靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為51.%、59.1%、60.9%和50%，與Mao等[20]報道一致，提示血清GP73檢測難以鑒別肝硬化和肝癌，但血清GP73可在一定程度上作為反映肝纖維化嚴重程度的有效血清學診斷指標。

本研究通過繪制ROC曲線，得出血清DCP、GP73及AFP的3項檢測指標的AUC，發(fā)現(xiàn)HBV相關性HCC與健康對照組、慢性乙型肝炎組比較AUC均為0.7～0.9，表明3項指標對鑒別HBV相關性HCC組與健康對照組和慢性乙型肝炎組的診斷均有一定的準確性。但3項指標對鑒別HBV相關性HCC與肝硬化的診斷效能不高，考慮臨床中HBV相關性HCC可同時伴有肝硬化的存在。

單項檢測血清學指標仍存在敏感性低的缺陷，需要多項血清學指標聯(lián)合檢測來提高診斷率。本研究對3項指標進行聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)，血清DCP、GP73及AFP聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為98.9%、98.6%、96.4%和98.6%，表明聯(lián)合檢測3項指標極大提高了HBV相關性HCC診斷的敏感性，可提高HBV相關性HCC患者的檢出率，減少了漏診率，有助于HCC的早期診斷。聯(lián)合檢測的陰性預測值高達98.6%，對HCC的排除診斷有很大的參考價值。然而，不可忽略的是3項指標聯(lián)合檢測靈敏度增高的同時，特異度也隨之下降，誤診率可能隨之增加，仍需結合患者一般情況、臨床癥狀、實驗室檢查結果、病理或影像學資料進行綜合判斷，爭取做到在提高檢出率的同時，最大限度地降低誤診率。

由于DCP、GP73及AFP3項指標對鑒別HBV相關性HCC與肝硬化的診斷效能不高，本研究創(chuàng)新采用了SVM模型在對于HBV相關性HCC組與HBV相關性肝硬化組和乙型肝炎組均具有較好的診斷效果。SVM是一種基于統(tǒng)計學習理論和結構風險最小化原則的學習方法，是一種多元統(tǒng)計分析方法，在多變量分析與識別等方面有著廣泛的應用[21-23]。其基本原理是將原始測試數(shù)據(jù)映射至更高維的空間，再通過尋找合適的超平面解決相應的分類問題[24]。在更多變量的空間，通過使用核函數(shù)將原有的數(shù)據(jù)映射到高維空間，需要使用相應的核函數(shù)完成。在建立該模型時，應當從原始數(shù)據(jù)集中選取適當?shù)臄?shù)據(jù)作為訓練集訓練該模型，而后對其余的數(shù)據(jù)(測試集)進行相關測試，得出相應的診斷與預測結果。常用的劃分訓練集與測試試集的方法有隨機法[25]和Kennard-stone(K-S)法[26]。隨機法選取的數(shù)據(jù)隨機性較大，所選樣品可能不具有代表性，模型預測結果不穩(wěn)定。KS法主要是根據(jù)數(shù)據(jù)間的歐氏距離來選取，選取的訓練比較具有代表性。SVM模型在HBV相關性HCC組與健康對照組應用時，特異度和敏感度均達到了98.6%；診斷HBV相關性HCC與HBV相關性肝硬化時，特異度和敏感度分別達到了90.91%和96.3%，這兩次SVM的診斷效果均優(yōu)于腫瘤標志物的診斷效果。因此，SVM模型可以考慮用于不同階段肝病的診斷與識別。

本研究樣本量偏少，未來可進行更大樣本數(shù)量的前瞻性研究，進一步減少其他因素影響產(chǎn)生的偏倚。通過分析獲得的結論尚需要大樣本、多中心及長時間的隨訪研究進行證實。本研究建立的診斷模型為提高HCC早期診斷提供了思路和方法，但僅僅依靠上述模型對HCC進行早期診斷顯然還不理想，結合相應的影像學指標或許可以進一步提高早期肝癌的檢出率。