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    血漿HOXA7基因甲基化在非小細(xì)胞肺癌診斷中的應(yīng)用*

    2019-07-15 06:00:14郭丹楊建偉楊亮石科
    中國腫瘤臨床 2019年10期
    關(guān)鍵詞:敏感度甲基化標(biāo)志物

    郭丹 楊建偉 楊亮 石科

    肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率較高[1-2],因此尋找有效的肺癌診斷方法具有重要的意義。功能基因的異常高甲基化發(fā)生在腫瘤的較早階段,是腫瘤細(xì)胞的一個重要的分子特征,因此可以作為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物[3-4]。腫瘤DNA 在細(xì)胞自然死亡后被釋放到血液或體液中,這些循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)不僅攜帶著腫瘤細(xì)胞的遺傳信息,并且保持著表觀遺傳學(xué)上的變化[5]。因此,血漿基因甲基化檢測對肺癌診斷具有一定的臨床價值。

    同源盒基因(homeobox,HOX)是編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因家族,對胚胎的發(fā)育具有非常重要的作用。在肺癌和其他類型的腫瘤中,HOX 基因是CpG 島甲基化的研究熱點[6]。HOX 基因家族無論在肺癌細(xì)胞系、鱗狀Ⅰ期腫瘤,還是混合期腫瘤中都普遍存在甲基化[7]。癌癥基因組圖譜(TCGA)研究發(fā)現(xiàn)HOXA7在肺鱗癌和腺癌組織中存在非常普遍的DNA 甲基化,但在正常的肺組織中卻尚未發(fā)現(xiàn)[8]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)Ⅰ期和ⅡA 期患者的血漿和痰液中都檢測到HOXA7 基因甲基化[9]。但HOXA7基因甲基化在診斷NSCLC中的價值尚不清楚。此外,關(guān)于血漿HOXA7 基因甲基化和其他肺癌診斷標(biāo)志物相關(guān)性的研究鮮見報道。因此,本研究通過檢測NSCLC 患者血漿中HOXA7 基因甲基化水平,探討HOXA7 基因甲基化水平與肺癌診斷標(biāo)志物、肺癌類型、TNM 分期的關(guān)系,旨在闡明血漿HOXA7甲基化在NSCLC臨床鑒別診斷中的價值。

    1 材料與方法

    1.1 病例資料

    選取河南省腫瘤醫(yī)院2012年1月至2016年12月80例住院的經(jīng)病理組織學(xué)確診為NSCLC患者為試驗組,50例健康人為對照組。入選標(biāo)準(zhǔn):1)無肺部手術(shù)治療史;2)未經(jīng)肺癌任何相關(guān)化療、免疫治療等;3)肺癌為原發(fā)性腫瘤并無其他腫瘤病史。入選肺癌患者和健康人群的基本資料見表1,本研究經(jīng)河南鄭州大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),并獲得患者家屬知情同意。

    1.2 方法

    1.2.1 腫瘤標(biāo)志物檢測 采取患者手術(shù)前空腹外周靜脈血5 mL,3 000 r/min 離心10 min 取上清液,參照Elecsys 2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套的測定試盒(上海羅氏有限公司)使用說明書,使用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、細(xì)胞角蛋白19 片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,cyfra21-1)和糖類抗原(carbohydrate antigen 199,CA199)水平。

    1.2.2 血漿DNA 提取和修飾 抽取患者手術(shù)前空腹外周靜脈血10 mL于EDTA 抗凝血管中,立即進行3 000 r/min 離心10 min 分離血漿,使用QIAamp DNA Mini Kit(德國QIAGEN 公司)分離血漿DNA,Nanodrop100 核酸定量分析儀(美國Thermo 公司)測定DNA 的純度和濃度,要求所提DNA 的A260/A280在1.7~1.9 之間。使用EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒(美國ZYMO公司)對所提取DNA進行亞硫酸氫鈉修飾備用。

    表1 肺癌患者和健康人群的基本資料 n(%)

    1.2.3 HOXA7 基因甲基化的qMSP 分析 采用定量甲基化特異PCR(quantitative methylation-specific PCR,qMSP)檢測患者ctDNA 中HOXA7 基因甲基化水平,引物和探針序列見表2。每個反應(yīng)體系為25 μL,包括2 μL亞硫酸修飾后的DNA、300 nmol/L正向引物和反向引物、100 nmol/L探針、100 nmol/L熒光染料、1.67 mmol/L dNTPs 和1 mL Platinum Taq DNA 聚合酶(美國Invitrogen 公司)。在96 孔板中每個樣本重復(fù)3 次。反應(yīng)條件為95℃5 min,95℃15 sec,65℃1 min,72℃1 min,共50個循環(huán)在Step One Plus Real-Time PCR儀(美國Applied BioSystems公司)上進行擴增。HOXA7的甲基化水平的計算采用2-ΔCT表示[9]。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。構(gòu)建受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,計算AUC 值用于評估各指標(biāo)在診斷肺癌中的性能,并計算cutoff值,統(tǒng)計各指標(biāo)診斷肺癌的靈敏度和特異度。兩組之間HOXA7甲基化差異分析用χ2檢驗。Pearson相關(guān)性分析對肺癌組織中各指標(biāo)之間的相關(guān)性。用Medcalc 軟件中的Delong 法對不同指標(biāo)檢測NSCLC 的ROC 曲線進行統(tǒng)計學(xué)分析。以P>0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表2 引物和探針序列

    2 結(jié)果

    2.1 NSCLC患者血漿中HOXA7啟動子甲基化檢測

    通過qMSP 檢測NSCLC 患者和健康人群血漿中HOXA7基因啟動子甲基化水平,經(jīng)ROC曲線分析顯示,AUC為0.813,95%CI為0.741~0.884,根據(jù)ROC制定診斷界值,采用約登指數(shù)最大法得到cutoff 值為2.308,HOXA7甲基化診斷NSCLC的敏感度為68.8%(55/80),特異度為86.0%(43/50)。與健康對照組相比,NSCLC患者血漿中發(fā)現(xiàn)更高的HOXA7 DNA甲基化水平,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.972,P<0.000 1,圖1)。

    圖1 血漿HOXA7基因啟動子甲基化水平

    2.2 血漿HOXA7甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

    NSCLC 患者血漿HOXA7 甲基化與性別、年齡和有無吸煙史無關(guān)(均P>0.05,表3),血漿HOXA7甲基化水平在鱗癌患者為71.8%(28/39),腺癌患者為65.9%(27/41),兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但HOXA7甲基化與TNM 分期有關(guān)(P<0.05),其中Ⅳ期患者血漿HOXA7 甲基化水平最高為81.8%(18/22),為Ⅲ期68.6%(24/35)、Ⅱ期67.4%(11/17)和Ⅰ期11.1%(1/9)。

    2.3 血漿HOXA7甲基化和腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析

    經(jīng)分析HOXA7 甲基化與Cyfra21-1 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.564,P<0.05)。但HOXA7 甲基化與CA199 和CEA 的相關(guān)系數(shù)分別為0.202(P<0.05)和-0.060(P>0.05),說明HOXA7 甲基化與Cyfra21-1 之間的相關(guān)性較好。

    表3 血漿HOXA7甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析

    2.4 血漿HOXA7甲基化聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物檢測NSCLC的診斷價值

    對3種血清腫瘤標(biāo)志物進行了ROC曲線分析(圖2,表4),AUC值從高到低分別為Cyfra21-1(0.786)、CEA(0.662)和CA199(0.522),其中Cyfra21-1診斷NSCLC的敏感度為70.00%,特異度為90.00%。與3種血清腫瘤標(biāo)志物相比,HOXA7 甲基化的診斷價值最高(AUC=0.813)。經(jīng)Medcalc軟件分析顯示,HOXA7甲基化的AUC與Cyfra21-1相比無顯著性差異(P>0.05),而與CA199和CEA相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    CEA+CA199+Cyfra21-1三指標(biāo)聯(lián)合診斷NSCLC的AUC為0.810,敏感度為65.00%,特異度為94.00%。CEA+CA199+HOXA7甲基化聯(lián)合診斷NSCLC的敏感度最高為76.25%,Cyfra21-1+HOXA7甲基化聯(lián)合診斷NSCLC的特異度最高為96.00%。HOXA7甲基化聯(lián)合三指標(biāo)(四指標(biāo)聯(lián)合)診斷NSCLC的效能最高,AUC為0.893,敏感度和特異度分別為73.75%和94.00%。

    表4 血漿中3種腫瘤標(biāo)志物和HOXA7甲基化對NSCLC的診斷價值評估

    3 討論

    肺組織的血管豐富,與外周血液循環(huán)的具有緊密聯(lián)系,所以ctDNA水平和分子特征在肺癌診斷中起著重要的作用。研究顯示,肺癌患者的ctDNA水平比正常人高[10]。肺癌組織DNA和血清ctDNA中癌基因和抑癌基因的改變具有高度的一致性[11],說明檢測ctDNA 中特殊分子的改變可以作為一種非侵入性的手段診斷腫瘤,其中研究最多的是基因甲基化[10]。

    HOX 基因參與個體發(fā)育和細(xì)胞分化,在胚胎發(fā)育中決定身體節(jié)段邊界。HOX基因通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá),影響細(xì)胞的多種生物學(xué)功能,如增殖、生存、遷移、分化以及血管的生成[12]。HOX基因家族包括A、B、C和D四個亞族。研究表明,HOXA家族基因在NSCLC 中表達(dá)下降,有可能是通過基因甲基化導(dǎo)致的表達(dá)下調(diào)[6]。HOXA 基因在多種腫瘤中表達(dá)異常,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如FGF、Wnt、RA 等,與腫瘤的分期和預(yù)后有關(guān)[13],其中HOXA7 已成為急性髓性白血病生存率差的預(yù)測因子之一[14],且在早期的肺腺癌和鱗癌組織中普遍都存在HOXA7 基因甲基化[7],對原發(fā)性肺鱗狀細(xì)胞癌中HOXA基因的甲基化分析發(fā)現(xiàn),HOXA7相關(guān)的CpG島是I期腫瘤中常見的甲基化靶點,肺癌組織中有45.00%HOXA7 CpG 島發(fā)生甲基化[6]。

    本研究結(jié)果表明,NSCLC 患者血漿中HOXA7 甲基化水平明顯高于健康人,與文獻報道一致[15]。Hulbert 等[9]報道NSCLC 患者痰液中HOXA7甲基化的診斷效率較高,AUC 為0.77,敏感度和特異度分別為63.00%和92.00%。本研究中血漿HOXA7 甲基化診斷NSCLC 的AUC 為0.813,敏感度和特異度分別為68.80%和86.00%。此外,本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者血漿HOXA7甲基化與性別、年齡、有無吸煙史和病理類型均無關(guān)(P>0.05),但與TNM 分期有關(guān)(P<0.05),從Ⅰ期到Ⅳ期NSCLC患者血漿HOXA7甲基化水平逐漸升高,其中Ⅳ期患者血漿HOXA7 甲基化水平達(dá)81.80%(18/22),說明血漿HOXA7甲基化水平與NSCLC的惡性程度有關(guān),參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

    檢測血清中腫瘤標(biāo)志物的水平因具有快捷、靈敏度高的優(yōu)點而被廣泛用于臨床,肺癌標(biāo)志物有CEA、CA199、Cyfra21-1 等。研究表明,在NSCLC 和SCLC 患者血清中都發(fā)現(xiàn)異常高水平的CEA[16-17],Liu等[18]報道Cyfra21-1是NSCLC 最靈敏的標(biāo)志物,治療前Cyfra21-1 水平可以作為SCLC 患者預(yù)后差的指標(biāo)。CEA 和CYFRA 21-1 是診斷肺癌的可靠血清腫瘤標(biāo)志物[19]。本研究結(jié)果顯示,Cyfra21-1 診斷NSCLC 的AUC 值最大,敏感度和特異度分別為70.00%和90.00%,CEA 診斷NSCLC 的敏感度和特異度分別為42.50%和72.00%。Okamura 等[20]報道,Cyfra21-1的敏感度和特異度分別為43.00%和89.00%,CEA 診斷肺癌的敏感度和特異度分別為69.00%和68.00%,本研究所用的樣本為NSCLC患者血清,說明Cyfra21-1 在診斷NSCLC 有更高的敏感度。此外,本研究結(jié)果中CA199 診斷NSCLC 的敏感度較低,僅為23.75%,與Okamura等文獻報道一致。

    多項腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測能夠提高檢測效率[21],本研究對Cyfra21-1、CA199、CEA 腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷進行分析發(fā)現(xiàn),NSCLC 的AUC 值增高0.810,敏感度下降至65%,特異度增高至94%。當(dāng)增加HOXA7甲基化檢測指標(biāo)后,診斷NSCLC的效能最高,AUC 為0.893,敏感度和特異度達(dá)73.75%和94%。此外,HOXA7 甲基化與Cyfra21-1 水平具有相關(guān)性,說明HOXA7 甲基化可以作為NSCLC 標(biāo)志物,并且可以提高血清腫瘤標(biāo)志物診斷的敏感度。

    本研究表明,在血漿中檢測HOXA7 基因啟動子甲基化可獲得較高的早期診斷NSCLC 準(zhǔn)確性,HOXA7 甲基化和惡性程度相關(guān),聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物檢測可以提高NSCLC的診斷效能。本研究仍需擴大樣本量以保證結(jié)論的科學(xué)性,相信檢測血漿基因甲基化可作為CT篩查的輔助工具,識別肺癌高?;颊?,減少假陽性結(jié)果,減少不必要的檢測,提高肺癌早期診斷水平。

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