不同濃度己酮可可堿對精子功能的影響研究

張慧娜　王麗媛　習(xí)海濤

[摘要] 目的 探討不同濃度己酮可可堿對精子功能的影響。 方法 選擇37例弱精患者的精液標(biāo)本作為研究對象。所有研究對象均禁欲3～7 d后，采用手淫法取得全份新鮮精液標(biāo)本，用計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）檢測精子各項(xiàng)參數(shù)。加入己酮可可堿使其終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、3.0 mmol/L、5.0 mmol/L，檢測精子活力和活率及運(yùn)動(dòng)功能[包括精子直線速度（VSL）和曲線速度（VCL）]。 結(jié)果 與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時(shí)間精子活力、精子活率、VSL和VCL均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min精子活力、精子活率、VSL和VCL增加（P<0.05）。 結(jié)論 己酮可可堿濃度1.0 mmol/L孵育60 min對精子功能效果最好，精子活力、精子活率及精子運(yùn)動(dòng)功能最佳。

[關(guān)鍵詞] 己酮可可堿;精子活力;精子活率;精子運(yùn)動(dòng)功能

[中圖分類號(hào)] R698.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）15-0035-04

Effect of different concentrations of pentoxifylline on sperm function

ZHANG Huina? ?WANG Liyuan? ?XI Haitao

Reproductive Center， Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325200， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of different concentrations of pentoxifylline on sperm motor function. Methods The semen specimens of 37 patients with weak sperm were used as research objects. All subjects were abstinent for 3-7 days， and all the fresh semen samples were obtained by masturbation. Computer-assisted sperm analysis（CASA） was used to analyze sperm parameters. Pentoxifylline was added to make the final concentration was 0.1 mmol/L， 0.3 mmol/L， 0.6 mmol/L， 1.0 mmol/L， 3.0 mmol/L， 5.0 mmol/L. The sperm motility and sperm motility rate and sperm motor testing （including sperm linear velocity（VSL） and curvilinear velocity（VCL） was detected. Results Compared with the those of 0.1 mmol/L group， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in remaining groups increased at different time points（P<0.05）. Compared with those of 0.3 mmol/L group， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in 0.6 mmol/L group， 1.0 mmol/L group， 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group increased（P<0.05）. Compared with those of 0.6 mmol/L group，the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL increased in the 1.0 mmol/L group， 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group（P<0.05）. The sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in the 1.0 mmol/L group were higher than those of 3.0 mmol/L group and 5.0 mmol/L group（P<0.05）. Compared with those at 10 min， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL in the different concentration groups increased at 30 min， 60 min and 120 min（P<0.05） except for the 0.1 mmol/L group. Compared with those at 30 min， the sperm motility， sperm motility rate， VSL and VCL increased in the different concentration groups at 60 min（P<0.05） except for the 0.1 mmol/L group. Conclusion The concentration of pentoxifylline at 1.0 mmol/L for 60 min has the best effect on sperm function， sperm motility， sperm motility rate and sperm motor function.

[Key words] Pentoxifylline; Sperm motility; Sperm motility rate; Sperm motor function

隨著現(xiàn)代社會(huì)工業(yè)化發(fā)展，輻射、藥物及環(huán)境毒物等的毒副作用及遺傳因素的影響，人類的精子數(shù)量和質(zhì)量呈現(xiàn)出普遍下降趨勢，男性不孕育的比例顯著增加[1-2]。探討改善和提高男性精子活力和質(zhì)量的新方法已成為當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。為改善患者精子活力并增強(qiáng)弱精子癥的受精能力，人們已經(jīng)嘗試研究過多種體外精子制備技術(shù)和化學(xué)刺激試劑，將精子同活力刺激藥物混合孵育來改善人工受精和試管成功率[3-4]。己酮可可堿是甲基黃嘌呤中一種，具有改善少弱精子癥的活力[5]。因此，本文研究旨在探討不同濃度己酮可可堿對精子功能的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017年6～12月在我院就診的弱精患者37例的精液標(biāo)本作為研究對象，所有研究對象均依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）精子的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入的37例患者中，年齡21～32歲，平均（27.43±4.13）歲;職業(yè)：公務(wù)員8例，工人13例，農(nóng)民12例，其他4例;合并糖尿病5例，合并高血壓9例。所有研究對象均禁欲3～7 d后試驗(yàn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲且≤40歲;（2）血常規(guī)、肝腎功能正常;（3）獲得知情同意，簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心肺、肝腎功能嚴(yán)重異常者;（2）精神疾病者;（3）合并腫瘤、免疫性疾病及造血系統(tǒng)等異常者。

1.2 方法

所有研究對象均禁欲3～7 d后，采用手淫法取得全份新鮮精液標(biāo)本，將其放置于37℃條件下，恒溫水浴箱中30 min左右，完全液化后備檢。用計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）檢測精子各項(xiàng)參數(shù)，每份標(biāo)本觀察精子數(shù)≥200個(gè)，且觀測15個(gè)視野，測定精子活力和活率。

正常精液標(biāo)本置于37℃水浴箱20 min，待其完全液化后，每份精液各取1 mL，置于離心管內(nèi)，用含10%血清Earles培養(yǎng)液（美國Sigma公司）1：1對倍稀釋;加入10%血清Earles培養(yǎng)液2 mL充分混合均勻，以離心半徑10 cm、1500 r/min，離心8 min;將上清液棄去，加入含10%血清Earles培養(yǎng)液2 mL充分混合均勻，以離心半徑10 cm、1500 r/min，離心8 min;將上清液棄去，混勻沉淀物，緩慢加入10%血清Earles培養(yǎng)液1.5 mL左右，注意形成界面，放置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中上游30 min;收集云霧狀的上清液混合于無菌玻璃管，加入BWW培養(yǎng)液調(diào)整精子密度至20×106/mL備用。加入己酮可可堿使其終濃度分別為0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、3.0 mmol/L、5.0 mmol/L。并且在孵育10 min、30 min、60 min、120 min進(jìn)行活力和活率檢測及精子運(yùn)動(dòng)功能檢測[包括精子直線速度（VSL）和曲線速度（VCL）]。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）觀察不同濃度己酮可可堿作用不同時(shí)間精子活力變化;（2）觀察不同濃度己酮可可堿作用不同時(shí)間精子活率變化;（3）觀察不同濃度己酮可可堿不同作用時(shí)間對精子運(yùn)動(dòng)功能的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0分析處理數(shù)據(jù)，其中對于多組間計(jì)量資料采用方差分析，兩組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)計(jì)量資料采用配對t檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度己酮可可堿作用不同時(shí)間精子活力變化比較

見表1。與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時(shí)間精子活力均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活力增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組精子活力高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min精子活力增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min精子活力增加（P<0.05）。

2.2 不同濃度己酮可可堿作用不同時(shí)間精子活率變化比較

見表2。與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時(shí)間精子活率均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活率增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組精子活率增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組精子活力高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min精子活率增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min精子活率增加（P<0.05）。

2.3 不同濃度己酮可可堿不同作用時(shí)間對精子運(yùn)動(dòng)功能變化比較

見表3。與0.1 mmol/L組比較，其余各組不同時(shí)間VSL和VCL均增加（P<0.05）;與0.3 mmol/L組比較，0.6 mmol/L組、1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組VSL和VCL增加（P<0.05）;與0.6 mmol/L組比較，1.0 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組VSL和VCL增加（P<0.05）;1.0 mmol/L組VSL和VCL高于3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組（P<0.05）;與10 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在30 min、60 min和120 min VSL和VCL增加（P<0.05）;與30 min比較，除0.1 mmol/L組外，其余各組濃度在60 min VSL和VCL增加（P<0.05）。

3 討論

精子運(yùn)動(dòng)是一個(gè)高度消耗能量的過程。精子線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ATP可能是精子活動(dòng)的能量，且受酵解過程直接影響[6]。推測精子代謝過程主要是糖酵解及少量的氧化磷酸化作用所產(chǎn)生，這些過程均受細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)控制[7-10]。己酮可可堿是從可可豆中提取的可可豆堿，再引入己酮基而得到的一種生物堿，為黃嘌呤衍生物，其分子式為C13H20N4O3，化學(xué)名稱為3，7-二甲基磺嘌呤，具有類似可可堿、咖啡因和茶堿的特性，是一種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，能夠阻止環(huán)腺苷酸（cAMP）轉(zhuǎn)為腺苷酸（AMP），防止cAMP的降解，從而使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高[11-14]。cAMP則是影響精子代謝過程的一個(gè)關(guān)鍵因素。大量研究證實(shí)，其參與了許多與精子生理和受精能力相關(guān)的關(guān)鍵過程：如超激活運(yùn)動(dòng)（hyperactivated motility，HAMA）和精子頂體反應(yīng)（acrosome reaction，AR）[15-16]。

己酮可可堿刺激精子活力及功能的機(jī)制尚未被完全闡明。cAMP涉及多種精子功能的調(diào)控，如精子尾部軸絲的運(yùn)動(dòng)、離子流入和蛋白質(zhì)的磷酸化作用，影響精子活動(dòng)所需能量的產(chǎn)生，從而加強(qiáng)人精子的活動(dòng)能力[17]。cAMP改善精子能力的另一可能機(jī)制是調(diào)節(jié)精子細(xì)胞膜上鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，引起細(xì)胞鈣離子發(fā)生相應(yīng)變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化。鈣離子是細(xì)胞第二信使，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改變是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是多種受體激活后信號(hào)傳遞的中心環(huán)節(jié)。精子膜上含有豐富的多聚不飽和脂肪酸及多種蛋白成分，精子膜完整且具有良好的功能與精子獲能、頂體反應(yīng)及精卵結(jié)合密切相關(guān)。過氧化物歧化酶可能被一種膜結(jié)合蛋白系統(tǒng)調(diào)節(jié)，PTX刺激這種蛋白激酶系統(tǒng)且抑制活性氧類物質(zhì)產(chǎn)生，可能作為一種抗氧化劑及自由基清除劑，通過降低細(xì)胞內(nèi)自由基水平，去除自由基上形成的過氧化物而達(dá)到保護(hù)頂體膜且維護(hù)頂體反應(yīng)的作用[18]。

在哺乳動(dòng)物精子中如果是短時(shí)間用己酮可可堿處理，精子可以對PTX的毒性產(chǎn)生較強(qiáng)的耐受性，而較長時(shí)間的處理會(huì)對受精卵和早期胚胎產(chǎn)生很強(qiáng)的毒性作用。采用體外活體染色方法觀察結(jié)果表明：隨著己酮可可堿處理精子時(shí)間的過分延長，精子膜的完整性明顯降低，精子死亡率增加。過多的處理過程本身也可能造成精子功能減退及與透明帶結(jié)合能力的喪失[19-20]。因此己酮可可堿孵育時(shí)間及濃度差異甚至精子的制備，不同的檢測方法及評價(jià)體系都可能造成最終結(jié)果的差異。本文研究表明，1.0 mmol/L組精子活力、精子活率、VSL和VCL高于0.1 mmol/L組、0.6 mmol/L組、3.0 mmol/L組和5.0 mmol/L組，60 min精子活力、精子活率、VSL和VCL高于10 min、30 min和120 min。

綜上所述，己酮可可堿濃度1.0 mmol/L孵育60 min對精子功能效果最好，精子活力、精子活率及精子運(yùn)動(dòng)功能最佳。由于目前臨床上相關(guān)研究報(bào)道甚少，缺乏有效的臨床參考價(jià)值。本文作為初步探討，筆者認(rèn)為存在一些不足之處，觀察研究對象相對較少，納入濃度相對較少，因此還需在后續(xù)進(jìn)一步研究中增加研究對象和濃度，提供可靠的參考價(jià)值。

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