許 猛,袁 亮,李 偉,李燕婷*,趙秉強
(1 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室,北京 100081;2 浙江大學環(huán)境與資源學院,杭州 310058)
在鹽堿土地區(qū),鹽害會嚴重影響種子萌發(fā)和幼苗生長,造成作物后續(xù)生育時期生長質量乃至最終產(chǎn)量的大幅下降[1-4]。在評價作物耐鹽堿能力和篩選耐鹽堿品種時種子萌發(fā)和幼苗期也是必要或決定性的階段[4-7]。除種植耐鹽堿品種外,使用有效的外源物質也是減輕鹽害的重要手段[2]。作為一類生物活性物質,外源氨基酸具有調節(jié)作物生長發(fā)育、促進養(yǎng)分吸收利用、提高作物產(chǎn)量、改善作物品質、提高肥料利用率等多重增效作用[8-12]。大量研究表明[13-15],在NaCl脅迫下外源氨基酸還能夠通過抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調節(jié)途徑改善作物生理特性,增強葉片光合作用,促進生長發(fā)育,提高作物抗鹽脅迫能力。除中性鹽外,鹽堿土中還存在大量的堿性鹽。堿性鹽(Na2CO3) 不僅會引起鹽害,還會導致介質pH上升,對種子萌發(fā)和幼苗的毒害作用大于中性鹽 (NaCl)[16-18];以Na2CO3為主的蘇打鹽堿土在我國分布也較為廣泛[19]。因此研究外源氨基酸是否能夠緩解Na2CO3對作物的脅迫作用具有重要意義。
Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)外源脯氨酸能夠通過滲透調節(jié)系統(tǒng)提高植物體內脯氨酸含量以及提高抗氧化酶活性等以緩解作物遭受的Na2CO3脅迫。外源氨基酸能夠誘導抗堿脅迫響應基因的表達,提高煙草幼苗體內多種滲透調節(jié)物質含量,提高抗氧化酶活性,緩解幼苗膜脂過氧化程度,維持幼苗正常生長[21];外源絲氨酸在堿性土上可以增加大豆根瘤數(shù)量,促進大豆植株和根系生長,提高大豆產(chǎn)量[22]。相對于中性鹽,關于外源氨基酸在緩解作物堿性鹽脅迫中的作用研究報道較少,而對混合/復合氨基酸的作用更鮮見報道。味精尾液是谷氨酸工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢液,富含多種游離氨基酸,是一種廉價易得的混合氨基酸材料[9,23]。然而味精尾液中鈉離子含量較高,直接施用也會造成鹽害。本文采用以味精尾液為原料經(jīng)脫鹽濃縮、低溫干燥等專利工藝技術 (專利號:ZL201410026086.5) 制得的脫鹽味精尾液制劑,研究在Na2CO3脅迫下對小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響及作用機理,為脫鹽味精尾液在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,特別是鹽堿土地區(qū)的推廣應用提供科學依據(jù)和理論指導。
供試作物:不結球白菜 (Brassica chinensisL.),品種名上海青。
脫鹽味精尾液制劑 (以下簡稱尾液):采用中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所專利技術(ZL201410026086.5) 對工業(yè)味精尾液采用脫鹽濃縮、低溫干燥等工藝制得,其粗蛋白含量47.62%;游離氨基酸含量15.4%、谷氨酸11.6%、丙氨酸1.56%、天門冬氨酸0.49%、脯氨酸0.46%、甘氨酸0.18%、亮氨酸0.17%、色氨酸0.16%、其他氨基酸0.78%;Na+含量 1.2%;pH 3.9 (固水比為 1∶250)。
1.2.1 萌發(fā)試驗 脫鹽味精尾液制劑共設置六個濃度處理:0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。挑選整齊飽滿的小白菜種子用10% NaClO消毒15 min后,用滅菌蒸餾水沖洗3次,吸去多余水分,用不同濃度尾液浸種12 h。浸種完后,再用蒸餾水沖洗3次,吸去多余水分。將浸種后的種子均勻擺入鋪有2層無菌濾紙的9 cm培養(yǎng)皿內,分別加入5 mL含0、10、20、30 mmol/L Na2CO3的堿液后,置于25℃人工氣候箱內培養(yǎng)。試驗期間以稱重法補充蒸餾水,每皿50粒,重復4次。
每天記錄種子發(fā)芽數(shù),以胚芽達到種子長度的一半以上或胚根達到種子長度為發(fā)芽。第2天計算發(fā)芽勢;第4天結束試驗并計算發(fā)芽率,測定胚根長、胚芽長。發(fā)芽勢 (%) = 前2天總發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù) × 100;發(fā)芽率 (%) = 前4天總發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù) × 100。
1.2.2 幼苗生長發(fā)育試驗 采用穴盤育苗,待小白菜幼苗長到2葉1心時選擇整齊一致的幼苗,移至含有1/2 Hoagland營養(yǎng)液中緩苗。緩苗后,分別加入濃度為0、2.5、5、10 mmol/L的Na2CO3和尾液于全Hoagland營養(yǎng)液中,處理濃度及各處理營養(yǎng)液的pH及電導率值見表1。每個處理重復3次,各重復3棵幼苗。每兩天更換一次營養(yǎng)液。培養(yǎng)10天后,進行指標測定。
測定根長 (最長根)、株高、生長量 (地上部、地下部重量之和),最大葉片SPAD值采用日本產(chǎn)SPAD-502葉綠素儀測定;葉片超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用氮藍四唑光化學還原法[24]測定,過氧化物酶 (POD) 活性采用愈創(chuàng)木酚法[24]測定,過氧化氫酶 (CAT) 活性采用紫外線吸收法[25]測定,所有酶活性單位以樣品鮮重為基準;葉片丙二醛 (MDA) 含量采用硫代巴比妥酸法[25],葉片超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法[25]測定,脯氨酸 (Pro)含量采用磺基水楊酸法[26]測定。
試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013、DPS 9.0進行統(tǒng)計分析,采用LSD法進行差異顯著性檢驗。
表1 各處理營養(yǎng)液pH及EC值 (μS/cm)Table 1 pH and electrical conductivities (EC) of nutrient solutions after adding different amounts of tail liquid and Na2CO3
隨著Na2CO3濃度的提高,蒸餾水浸種小白菜種子的發(fā)芽勢迅速下降,嚴重抑制了種子的萌發(fā)。在無Na2CO3脅迫 (0 mmol/L Na2CO3) 下,尾液本身同樣會抑制發(fā)芽勢,且尾液濃度達到0.4 g/L時抑制作用達到顯著性水平。而在10、20、30 mmol/L Na2CO3條件下,小白菜種子發(fā)芽勢隨尾液濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢,且均以0.1 g/L添加效果最好,與不添加尾液相比發(fā)芽勢分別提高32.35%、18.87% 和 94.74% (圖1)。
脫鹽味精尾液可緩解Na2CO3脅迫對小白菜種子發(fā)芽的抑制作用。在不施用尾液的條件下,Na2CO3濃度越高對小白菜種子發(fā)芽的抑制作用也明顯越強;在無Na2CO3條件下,尾液本身會降低種子發(fā)芽率,且濃度達到0.8 g/L時最顯著。在各濃度Na2CO3條件下小白菜種子發(fā)芽率隨尾液濃度增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,以0.1 g/L尾液效果最好,與不添加相比發(fā)芽率分別提高6.56%、14.95%和72.73%(圖1)。
隨Na2CO3濃度的提高,小白菜胚根長下降非常迅速,10 mmol/L Na2CO3強烈抑制了胚根的伸長。在對照 (0 mmol /L Na2CO3) 條件下,除0.8 g/L尾液處理胚根長顯著下降55.41%外,其它處理與不添加相比差異不顯著。在10、20、30 mmol/L Na2CO3濃度下,隨尾液濃度提高,胚根長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,以0.1 g/L尾液促進胚根伸長的效果最好(圖2)。
圖1 不同Na2CO3脅迫下脫鹽味精尾液對小白菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Fig.1 Germination potential and rate of pakchoi seeds under different Na2CO3and tail liquid addition levels
圖2 不同Na2CO3脅迫下脫鹽味精尾液對小白菜胚根長和胚芽長的影響Fig.2 Length of root and plumule of pakchoi under different Na2CO3and tail liquid addition levels
Na2CO3濃度越高,對小白菜種子胚芽長的抑制作用越強烈。在不加Na2CO3條件下,與不添加尾液相比,除0.8 g/L尾液處理胚芽長顯著下降46.67%外,其它處理與不添加尾液差異均不顯著。在10 mmol/L Na2CO3濃度下與不添加尾液相比,0.05 g/L尾液處理胚芽長增加9.52%,之后隨著尾液濃度的升高,胚芽長呈現(xiàn)下降的趨勢。在20 mmol/L和30 mmol/L Na2CO3脅迫下,隨尾液濃度的上升,胚芽長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,以0.1 g/L尾液效果最好 (圖2)。
隨Na2CO3濃度的上升,不添加尾液處理的小白菜生長量呈現(xiàn)下降的趨勢,在10 mmol/L Na2CO3條件下生長量僅為對照條件下 (0 mmol/L Na2CO3) 的56.9%,嚴重阻礙了幼苗的生長。在對照條件下,尾液本身同樣會顯著降低生長量,且隨尾液濃度的增加,抑制作用增強。在不同堿濃度脅迫條件下,隨尾液濃度增加,小白菜生長量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢:在2.5 mmol/L Na2CO3條件下,以0.05 g/L尾液的效果最好,與不添加尾液相比其生長量顯著提高13.8%;而在5 mmol/L和10 mmol/L Na2CO3條件下,以0.1 g/L的效果最好,與不添加尾液相比生長量分別顯著提高40.7%和32.0%;高濃度 (0.4~0.8 g/L) 尾液在各堿濃度條件下均會顯著抑制小白菜的生長。在同一尾液濃度下,隨Na2CO3濃度上升,鮮重均表現(xiàn)出先升后降的趨勢 (圖3)。
圖3 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜鮮重的影響Fig.3 Fresh weight of pakchoi under different Na2CO3and tail liquid addition levels
隨Na2CO3濃度上升,不添加尾液處理的小白菜葉片SPAD值先保持平穩(wěn),但在10 mmol/L Na2CO3條件下SPAD值迅速下降僅為對照的56.86%。在不加Na2CO3條件下,與不添加尾液相比,添加0.05 g/L尾液處理葉片SPAD值基本持平,之后隨著尾液濃度的增加,SPAD值迅速下降,0.1 g/L尾液處理SPAD值即顯著下降47.36%。在各堿脅迫條件下,隨尾液濃度增加,SPAD值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢:在2.5 mmol/L Na2CO3條件下,以0.05 g/L尾液效果最好,與不添加相比SPAD增加13.77%,而在5 mmol/L和10 mmol/L Na2CO3條件下以0.1 g/L效果最好;高濃度 (0.2~0.8 g/L) 尾液在各堿濃度下均會明顯降低SPAD值 (圖4)。
圖4 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜SPAD值的影響Fig.4 SPAD values of pakchoi under different Na2CO3and tail liquid addition levels
表2表明,隨Na2CO3濃度的上升,不添加尾液處理株高呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在10 mmol/L Na2CO3條件下株高僅為對照的70.44%,表明高Na2CO3濃度會顯著抑制小白菜莖的伸展。在不加Na2CO3條件下,隨尾液濃度增加,株高呈現(xiàn)一直下降的趨勢。在各堿濃度脅迫下,隨尾液濃度的上升,小白菜株高呈現(xiàn)先升后降的趨勢:在2.5、5 mmol/L Na2CO3濃度下以0.05 g/L添加量對促進株高的效果最好,與不添加處理相比株高分別增加4.22%、4.00%,但差異不顯著;在10 mmol/L Na2CO3濃度下,以0.1 g/L添加量植株最高,與不添加處理相比株高顯著增加17.25%。Na2CO3濃度越高對不添加尾液處理的小白菜根長抑制作用越強。在不加Na2CO3條件下尾液本身同樣會抑制根的伸長,且尾液濃度越高抑制作用越強。在2.5 mmol/L Na2CO3條件下,隨尾液濃度的增加,根長同樣一直下降,除0.05 g/L處理外其它處理均與不添加處理達到差異顯著性水平。在5、10 mmol/L Na2CO3條件下,與不添加處理相比,除0.05 g/L處理根長分別增加13.10%和8.07%外,其余尾液處理均顯著抑制小白菜根的伸長。
表2 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜株高和根長的影響Table 2 Shoot and root length of pakchoi under different Na2CO3concentrations and tail liquid addition levels
隨著Na2CO3濃度的上升,0 g/L尾液處理葉片超氧化物歧化酶 (SOD) 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在10 mmol/L Na2CO3條件下的SOD活性為對照條件 (0 mmol/L Na2CO3) 下的78.50%,顯著抑制了SOD的活性。在不加Na2CO3條件下,與不添加尾液處理相比,隨著尾液濃度的上升,SOD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢,SOD活性最高的0.1 g/L處理顯著上升34.17%,而最低的0.8 g/L處理下降10.01%。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3脅迫下,小白菜葉片SOD活性隨尾液濃度增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,以0.1 g/L尾液效果最好。
隨著Na2CO3濃度的上升,0 g/L尾液處理葉片過氧化物酶 (POD) 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在不加Na2CO3條件下,與不添加尾液處理相比,POD活性呈現(xiàn)“持平-上升-下降”的趨勢,以0.2 g/L處理活性最高,顯著增加43.66%。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3條件下,各濃度尾液能促進或保持POD活性,以0.05 g/L或0.1 g/L尾液添加效果最好 (表3)。
隨Na2CO3濃度的上升,0 g/L尾液處理葉片CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在不加Na2CO3條件下,隨尾液濃度的增加,各處理小白菜葉片CAT活性也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,均高于0 g/L處理。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3條件下,各尾液處理均能提高或保持小白菜葉片CAT活性,0.8 g/L尾液對提高小白菜葉片CAT活性的效果最好 (表3)。
高濃度Na2CO3會顯著提高無尾液處理葉片的活性氧產(chǎn)生速率。與對照相比,10 mmo/L Na2CO3條件下產(chǎn)生速率提高58.71%。在不加Na2CO3條件下,與無尾液處理相比,產(chǎn)生速率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,0.05 g/L處理的產(chǎn)生速率下降10.74%,而0.2~0.8 g/L處理增幅達38.32%~69.99%。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3濃度下,0.05~0.2 g/L尾液會使小白菜葉片產(chǎn)生速率下降;而高濃度尤其是0.8 g/L尾液則會加快或保持產(chǎn)生速率(表4)。隨Na2CO3濃度的增加,無尾液處理葉片的MDA含量呈現(xiàn)一直上升的趨勢,與對照相比,在10 mmol/L Na2CO3條件下MDA含量顯著增加達54.83%。在0~10 mmol/L Na2CO3濃度下,隨尾液濃度增加,小白菜葉片MDA含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在各濃度Na2CO3條件下,0.05~0.4 g/L尾液均能降低小白菜葉片MDA含量 (表4)。
表3 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜葉片抗氧化酶活性的影響Table 3 Activities of antioxidative enzymes in pakchoi leaves under different Na2CO3concentrations and tail liquid addition levels
隨著Na2CO3濃度的上升,無尾液處理葉片的Pro含量呈現(xiàn)“下降-上升-下降”的趨勢。在不加Na2CO3條件下,除0.05 g/L處理葉片的脯氨酸含量與無尾液處理相比基本持平外,其它處理均顯著增加。在2.5、5、10 mmol/L Na2CO3濃度下,低濃度(0.05~0.1 g/L) 尾液脯氨酸含量與不添加處理基本持平,高濃度 (0.2~0.8 g/L) 尾液會顯著增加小白菜葉片脯氨酸含量 (圖5)。
Na2CO3濃度越高對小白菜種子萌發(fā)的抑制作用越強。在30 mmol/L Na2CO3濃度下胚芽突破種皮后不再伸長,而胚根則在20 mmol/L Na2CO3濃度下突破種皮后不再伸長。這說明Na2CO3對胚根的抑制作用要大于胚芽,與藺吉祥等[18]和馬紅媛等[27]研究結果一致。試驗發(fā)現(xiàn),有的幼苗在15 mmol/L Na2CO3環(huán)境中即死亡,說明Na2CO3對小白菜幼苗的抑制作用要大于種子。這是因為種子有種皮的保護,能抵擋一定程度的逆境脅迫[18]。
外源物質浸種能夠“激活”作物的耐堿能力,使作物提前適應堿性鹽環(huán)境,是提高作物抗堿性的有效手段之一[28-29]。在本試驗Na2CO3濃度條件下,以0.1 g/L尾液浸種處理種子萌發(fā)質量最好,可明顯緩解Na2CO3對種子萌發(fā)的抑制,這可能是因為堿性鹽會導致滲透脅迫和離子毒害,造成種子內部蛋白酶等代謝不正常,而尾液中的氨基酸在浸種過程中可隨種子吸水作用進入種子內部,不僅可以提高種子蛋白酶、淀粉酶的活性,還可以降低細胞內的滲透勢,緩解滲透脅迫,增強種子活力,從而維持正常的萌發(fā)過程[30-32]。此外,種子萌發(fā)的代謝強度與細胞質膜的完整性密切相關,外源氨基酸可以提高種子抗氧化酶活性,緩解堿性鹽脅迫下活性氧累積對細胞質膜的傷害[33-34]。而尾液濃度過高 (> 0.4g/L) 則會加劇滲透脅迫對種子的抑制,同時尾液本身呈酸性并含有一定的鹽分,濃度過高也會造成酸害和鹽害,抑制種子萌發(fā)。
表4 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜葉片產(chǎn)生速率和丙二醛 (MDA) 含量的影響Table 4 producing rate and MDA content of pakchoi leaves under different Na2CO3and tail liquid addition levels
表4 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜葉片產(chǎn)生速率和丙二醛 (MDA) 含量的影響Table 4 producing rate and MDA content of pakchoi leaves under different Na2CO3and tail liquid addition levels
注(Note):同列數(shù)值后不同字母表示同一指標相同 Na2CO3濃度下不同尾液加入量處理間差異達 0.05 顯著水平 Values followed by different letters in same column represent significant differences among tail liquid treatments at the same Na2CO3concentration at the 0.05 level.
指標Index尾液用量 (g/L)Tail liquid addition Na2CO3水平 Na2CO3level (mmol/L)0 2.5 5 10產(chǎn)生速率producing rate[mol/(g·min),F(xiàn)W]0 0.30 bc 0.28 ab 0.42 a 0.48 a 0.05 0.27 c 0.18 b 0.36 b 0.43 ab 0.1 0.34 abc 0.20 b 0.26 c 0.34 b 0.2 0.52 a 0.18 b 0.26 c 0.42 ab 0.4 0.42 abc 0.27 ab 0.40 ab 0.53 a 0.8 0.48 ab 0.38 a 0.42 a 0.52 a MDA 含量MDA content(μmol/g,F(xiàn)W)0 10.70 d 14.63 b 14.95 a 16.57 a 0.05 6.60e 9.64 cd 13.38 ab 9.96 c 0.1 11.90 d 8.20 d 12.05 bc 11.62 bc 0.2 15.11 c 10.15 cd 11.50 bc 10.23 c 0.4 19.64 b 12.10 bc 9.96 c 14.40 ab 0.8 25.79 a 22.61 a 11.44 bc 16.14 a
圖5 不同Na2CO3濃度下脫鹽味精尾液對小白菜葉片脯氨酸含量的影響Fig.5 Proline concentration of pakchoi leaves under different Na2CO3and tail liquid addition levels
研究證明[35],氨基酸在堿性環(huán)境下能被小白菜直接吸收,可提供碳、氮營養(yǎng),參與植株體內的碳、氮轉化,調控代謝循環(huán),促進作物生長。在Na2CO3脅迫下,適宜濃度的尾液增強了幼苗的光合作用,促進了莖的伸展,增加了幼苗生長量,從而有效緩解了Na2CO3脅迫對小白菜幼苗的傷害。然而,脫鹽味精尾液濃度過高也會影響作物生長。水培試驗營養(yǎng)液最佳pH為5.5~6.5[36-37],但本文所用尾液呈酸性,濃度過高則使得營養(yǎng)液pH下降迅速(表1),阻礙了小白菜幼苗正常生長;同時,尾液本身也含有一定濃度的鹽,用量過高也會與Na2CO3一樣造成鹽害。因此,在無Na2CO3條件下,隨尾液濃度升高小白菜幼苗生長受到抑制,幼苗不能正常生長。在不同鹽堿脅迫下應使用適宜濃度的尾液。
綜上,脫鹽味精尾液之所以能夠緩解堿性鹽脅迫,可能是由于尾液本身呈酸性能中和一部分Na2CO3的堿害,但效果表現(xiàn)最好的尾液處理使營養(yǎng)液pH值下降幅度有限 (只有0.2左右,表1)。所以,更可能的原因是尾液中甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸等多種游離氨基酸共同發(fā)揮的作用。該結果也為味精尾液的減量化和資源化利用提供了新途徑。目前氨基酸營養(yǎng)的機理研究遠遠落后于市場應用,在以后的研究中,除了確定氨基酸類物質的使用量、使用時期、使用方法外,還應進一步明確其中各成分發(fā)揮的作用以及各成分之間可能存在的協(xié)同、拮抗作用,為氨基酸的進一步開發(fā)、利用提供依據(jù)。
1) 適宜濃度的脫鹽味精尾液能夠明顯緩解Na2CO3(10~30 mmol/L) 對小白菜種子萌發(fā)的抑制作用,提高小白菜種子的發(fā)芽勢、胚根長和胚芽長,以0.1 g/L尾液用量效果最好,發(fā)芽率較清水對照提高6.56%~72.73%。
2) 適宜濃度的脫鹽味精尾液能夠通過提高葉片抗氧化酶活性,緩解產(chǎn)生速率過快和MDA含量過高對幼苗造成的傷害,增強葉片光合作用,促進小白菜幼苗生長,從而緩解Na2CO3(2.5~10 mmol/L)對小白菜幼苗生長的抑制作用,其中以0.05~0.1 g/L尾液用量的效果最好。