分散液-液微萃取在法庭毒物分析中的應(yīng)用

楊煜，張云峰，李昕潼，王芳琳，何洪源，黃健

（1.中國人民公安大學(xué)，北京 102600；2.公安部物證鑒定中心，北京 100089）

在法庭毒物分析中，由于待分析對象的特異性和復(fù)雜性，需要在分析前對檢材進(jìn)行提取、純化和濃縮等前處理操作。分散液-液微萃取（dispersive liquidliquid microextraction，DLLME）因具有萃取速度快、富集倍數(shù)（用來描述樣品富集的程度，通常為前處理前后目標(biāo)物的工作曲線斜率之比）高、環(huán)境友好等特點而在眾多新型液-液萃取技術(shù)中脫穎而出，這種方法自2006年REZAEE等[1]報道以來吸引了化學(xué)分析從業(yè)者的關(guān)注，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各類基質(zhì)中各種類型分析物的提取。

DLLME是由水相、分散溶劑和萃取溶劑這三元組分組成的萃取系統(tǒng)，萃取劑能提取水相中目標(biāo)分析物，而分散劑則能使萃取溶劑在水相中實現(xiàn)較大程度的分散，因而分散溶劑和萃取溶劑的混合物快速注入水相中，形成無數(shù)萃取溶劑的微小液滴，即乳濁液，使水相和萃取溶劑的接觸表面成倍增加，目標(biāo)分析對象快速達(dá)到萃取平衡。由于需要形成較為穩(wěn)定的乳濁液，且大多數(shù)萃取完成時需離心分相，所以萃取劑的密度需要在接近水的情況下略大于水。因此，常用的萃取劑是重有機溶劑——鹵代化合物（如氯仿、四氯化碳等）和高密度、不揮發(fā)的離子溶液。但重有機溶劑萃取劑不利于提取凈化易產(chǎn)生沉淀物的樣品（血、胃內(nèi)容物、肝等），且毒性較大。研究人員因此開發(fā)密度小、無毒的萃取劑（low density solvent，LDS）如己烷、甲苯等[2-3]，這些萃取劑毒性小，但因密度小導(dǎo)致使用LDS進(jìn)行DLLME時需采用復(fù)雜的萃取裝置。其中，某些萃取劑可采取低溫固化分相，低溫化處理后轉(zhuǎn)移上層凝固的萃取相即可完成分相，即懸浮固化分散液-液微萃取（dispersion liquid-liquid microextractionsolidification floating organic drop，DLLME-SFO）。除此之外，研究人員開發(fā)了輔助萃取劑（auxiliary solvent，AS），AS可以調(diào)節(jié)萃取劑的密度，使萃取劑離心后能沉降于離心管底部。由于法庭科學(xué)中所涉樣品基質(zhì)復(fù)雜，DLLME處理后易出現(xiàn)干擾，反萃取劑（back extraction solvent，BES）可以將極性分析物從有機溶劑中反萃取到其他溶液中，從而降低基質(zhì)干擾，減小基質(zhì)效應(yīng)。分散劑需要將萃取劑和水相混溶，且在分相時形成兩相，常見的分散劑有甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑和表面活性劑。由于不同的萃取劑和分散劑對不同目標(biāo)分析物的提取能力不同，目標(biāo)分析物的富集倍數(shù)也有差異。

1 DLLME在法庭毒物分析中的應(yīng)用

DLLME已被廣泛應(yīng)用于法庭毒物的分析和檢驗中，如菊酯類農(nóng)藥、苯二氮藍(lán)卓類鎮(zhèn)靜藥、苯丙胺類毒品等，近年國內(nèi)外法庭毒物分析領(lǐng)域中DLLME的應(yīng)用如下。

1.1 農(nóng)藥分析的應(yīng)用

DLLME結(jié)合氣相色譜法分析農(nóng)藥已經(jīng)較為成熟。2012年，MUDIAM等[2]以100μL正己烷和300μL丙酮分別為萃取劑和分散劑，進(jìn)行了低密度溶劑DLLME富集大鼠組織和血液中的氯氰菊酯，使用氣相色譜-電子捕獲檢測器（gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD）檢測。氯氰菊酯的最低檢出限（limit of detection，LOD）分別為0.098～0.314ng/mg（大鼠腎、肝和腦組織）、8.6ng/mL（大鼠血液），回收率為81.6%～103.67%。隨后的兩年間，該研究小組還對大鼠腦組織中的3-苯氧基苯甲酸、4-苯氧基-3-羥基苯甲酸[4]，大鼠肝組織中的3-苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoic acid，3-PBA）[5]，土壤和尿液中的硫丹及其代謝物[6]進(jìn)行了DLLME富集并使用氣相色譜檢測。3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基-3-羥基苯甲酸的處理使用三氯乙烯和甲醇作為萃取劑和分散劑，LOD均在10 ng/g以下，土壤和尿液中硫丹及其代謝物的處理使用丙酮作為分散劑、三氯乙烯作為萃取劑，LOD 為 0.316～2.494 ng/g（土壤）、0.049～0.514 ng/mL（血液）。

DLLME與液相色譜聯(lián)用應(yīng)用于農(nóng)藥分析較少。2014年，LI等[7]以100μL 1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（1-hexyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[C6MIM][PF6]）離子液體作為萃取劑，200 μL甲醇作為分散劑，進(jìn)行了DLLME并通過高效液相色譜-二極管陣列檢測器（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）分析大鼠血液中的四種三唑類農(nóng)藥：菌唑、喹諾唑、戊菌唑和已唑醇的LOD在4～6 ng/mL，并獲得了178～197的富集倍數(shù)和88.9%～98.5%的回收率。但這種方法單次檢測時間為45min，對于繁重的司法鑒定工作而言效率過低。

1.2 鎮(zhèn)靜催眠藥物分析的應(yīng)用

鎮(zhèn)靜劑和催眠藥常見于法醫(yī)毒物檢驗，這些藥物廣泛用于治療失眠、驚厥發(fā)作和其他心理障礙，但是也具有一定的成癮性和毒副作用。

不同于農(nóng)藥，當(dāng)前法庭科學(xué)中使用DLLME提純鎮(zhèn)靜催眠藥物多與液相色譜分析相結(jié)合。FERNáNDEZ等[8]以250μL氯仿為萃取劑，2mL甲醇為分散劑進(jìn)行DLLME，分別結(jié)合高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）分析了人體血液中的7種苯二氮藍(lán)卓類藥物。使用UPLC法時，藥物的 LOD 分別為 1.8～5.3 ng/mL（C18柱）和2.9～10.6ng/mL（Shield RP18柱），使用HPLC法時，藥物的LOD為3.5～6.4ng/mL（Shield RP18柱），UPLC分析時間更短，回收率高且穩(wěn)定（80%～120%）。之后，該研究小組使用UPLC分析了醫(yī)院廢水和人體尿液的7種苯二氮藍(lán)卓類藥物[9]。采用1.6mL丙酮作為分散劑進(jìn)行DLLME，該方法的回收率為84%～124%，LOD為0.6～6.2 ng/mL。VARDINI等[10]以二氯甲烷作為萃取劑進(jìn)行DLLME，結(jié)合HPLC法分析了人尿液中的奧沙西泮、地西泮和阿普唑侖，其回收率、LOD與FERNáNDEZ等[8-9]的研究結(jié)果基本一致，但HPLC分析時間較長（27 min）。FARSIMADAN 等[11]以 30 μL乙醇和5 μL十一烷醇分別作為萃取劑和分散劑，萃取了血液和尿液中的地西泮、西酞普蘭和舍曲林，使用高效液相色譜檢測3種藥物的定量限在0.4～0.8ng/mL，富集倍數(shù)在383～445，回收率均高于92.9%。de BOECK等[12]以60μL 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[BMIm][PF6]）為萃取劑并使用旋轉(zhuǎn)混合器代替分散劑進(jìn)行DLLME，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測了血液中的19種安眠藥（7-氨基氟硝西泮、阿普唑侖、溴西泮、氯硝西泮、地西泮、艾司唑侖、氯氟西泮、依替唑侖、氟西泮、咪達(dá)唑侖、氯巴占、氯噻西泮、氯甲西泮、奧沙西泮、普拉西泮、替馬西泮、三唑侖、唑吡坦和佐匹克?。?，最終19種安眠藥的檢測限在0.003～4.740ng/mL，回收率為24.7～127.2%。除液相色譜外，DLLME也可結(jié)合其他方法分析催眠鎮(zhèn)靜藥物。2014年，GHOBADI等[13]以40μL氯仿作為萃取劑，0.5mL丙酮為分散劑和洗脫液進(jìn)行固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）-DLLME聯(lián)用富集人體尿液中的地西泮、咪達(dá)唑侖和阿普唑侖。該方法使用火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）進(jìn)行檢測，富集倍數(shù)為3 895～7 222，LOD為0.02～0.05 ng/mL，回收率為90%～98%。

1.3 毒品分析的應(yīng)用

毒品具有較強的依賴性，毒品檢驗是法庭科學(xué)的重要內(nèi)容。

1.3.1 麻醉藥品

2013年，AHMADI-JOUIBARI等[14]以500μL丙酮作為分散劑，30 μL 1-十一烷醇作為萃取劑進(jìn)行了懸浮固化DLLME，提純、富集并用高效液相色譜-紫外檢測法（high performance liquid chromatographyultraviolet，HPLC-UV）檢測了血液中嗎啡、可待因、罌粟堿和那可丁。這4種阿片類的LOD為0.5～5μg/L，血液中的富集倍數(shù)可達(dá)110.4～165。表2總結(jié)了DLLME在阿片類毒品分析中的應(yīng)用。

表2 DLLME在阿片類毒品分析中的應(yīng)用

大麻主要成分為四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）、大麻酚（cannabinol，CBN）和大麻二酚（cannabidiol，CBD）。2011年，MORADI等[3]聯(lián)用表面活性劑輔助DLLME和高效液相色譜-紫外檢測法分析了3位男性尿液中的THC、CBN和CBD。該方法使用1mL 0.5mmol/L西曲溴銨作為分散劑，85μL甲苯作為萃取劑，尿液中三種物質(zhì)的富集倍數(shù)為190～292，回收率為83.2%～117.1%，LOD為0.1～0.5ng/mL。

1.3.2 精神藥品

精神藥品主要有興奮劑、致幻劑、抑制劑。苯丙胺類毒品是世界上最為流行的合成毒品，主要有苯丙胺（amphetamine，AMP）、甲基苯丙胺（methamphetamine，MAMP）和亞甲二氧基甲基苯丙胺（3，4-methylene dioxy methamphetamine，MDMA）等。針對苯丙胺類毒品，當(dāng)前主要與DLLME聯(lián)用的分析方法為色譜方法和毛細(xì)管電泳法。2012年，SABER TEHRANI等[18]使用HPLC分析經(jīng)DLLME提純的含AMP和MAMP的尿液。使用56.5 μL 70 ng/mL十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）作為分散劑，31μL 1-十一烷醇作為萃取劑，加入2mL的尿液樣本，渦旋混合再離心后冰浴，轉(zhuǎn)移凝固的萃取劑進(jìn)行HPLC分析。經(jīng)分析，AMP和MAMP的LOD是2 ng/mL和3 ng/mL，尿液中回收率為91.1%～96.0%，富集倍數(shù)為48～56。2014年，AHMADI-JOUIBARI等[19]同樣使用DLLME-SFO提純并使用HPLC-UV研究了尿液中的AMP和MAMP，研究人員使用300μL乙腈作為分散劑，30μL 1-十一烷醇作為萃取劑。AMP和MAMP的LOD分別是8ng/mL和2 ng/mL，尿液中的回收率為87.8%～113.2%，富集倍數(shù)為58.5～62.4。對比乙腈，SDS溶液作為分散劑時，AMP和MAMP的LOD、回收率和富集倍數(shù)均無明顯差距，但SDS具有更高的環(huán)境友好度。

常見的合成致幻劑有麥角酸二乙基酰胺（lysergic acid diethylamide，LSD）和苯環(huán)己哌啶（phencyclidine，PCP）。AIRADO-RODRíGUEZ 等[20]以 0.606 mL二溴甲烷作為萃取劑、1.508 mL乙腈作為分散劑，進(jìn)行DLLME，富集了尿液中的MDMA、LSD和PCP，并使用毛細(xì)管電泳-紫外檢測法（capillary electrophoresisultraviolet，CE-UV）檢測，這三種毒品的LOD分別為1.00、4.41、4.52ng/mL。

國內(nèi)孟梁等[21]使用DLLME與CE-UV聯(lián)用分析了唾液中的MAMP、AMP、MDMA、MDA、氯胺酮、6-單乙酰嗎啡、嗎啡和可待因。研究人員使用41μL三氯甲烷作為萃取劑，0.46 mL異丙醇作為分散劑，進(jìn)行DLLME后，離心取沉降相，吹干再溶解后送CE-UV分析。唾液中8種毒品的LOD為0.055～0.135ng/mL，回收率為88.8%～101.0%。

抑制劑主要是指對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用的藥物，這類藥物已在1.2鎮(zhèn)靜催眠藥物分析的應(yīng)用中總結(jié)。

1.4 金屬毒物分析的應(yīng)用

螯合劑可以與金屬原子或離子產(chǎn)生配位體作用，生成具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物。分析金屬毒物時需要將金屬離子與螯合劑作用使其易溶于有機溶劑。LIANG等[22]以四氯化碳為萃取劑，乙醇為分散劑，使用1-苯基-3-甲基-4-苯甲?；?5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-4-benzoyl-2-pyrazolin-5-one，PMBP）為螯合劑進(jìn)行DLLME，并使用墨爐原子吸收光譜法（graphite furnace atomic absorptionspectrometry，GFAA）分析了尿液中超痕量的鉛。尿液中鉛的LOD為39pg/mL，回收率為94%～101%，富集倍數(shù)達(dá)到了78。SHOKOUFI等[23]使用四氯化碳作為萃取劑，乙醇作為分散劑，使用1，5-二苯基硫卡巴腙（二硫腙）作為螯合劑，進(jìn)行DLLME，采用激光誘導(dǎo)-熱透鏡光譜法（laser inducedthermal lens spectrometry，LI-TLS）分析了血液中的鉛。血液中鉛的LOD為0.01 μg/L，回收率為94.3%～102.0%。

2011年，SHIRKHANLOO等[24]使用DLLME與氫化物發(fā)生原子吸收光譜法（hydride generator-atomic absorption spectroscopy，HG-ASS）聯(lián)用分析了人體尿液和血液中超痕量的砷化合物。在該項研究中使用四氯化碳作為萃取劑，丙酮作為分散劑，進(jìn)行DLLME后，研究人員使用鹽酸溶液進(jìn)行反萃取后經(jīng)HG-ASS分析，結(jié)果顯示砷化合物在血液和尿液中的LOD均為5ng/mL，回收率為97%～102%。

2 展 望

法庭毒物分析的生物檢材基質(zhì)復(fù)雜，需要合適的萃取和富集方法對其進(jìn)行提取、凈化。DLLME法應(yīng)用于法庭毒物分析實驗室優(yōu)點很多，諸如簡單、成本低廉、回收率和富集倍數(shù)相對較高等。目前，國外DLLME法已被廣泛用于尿液、血液、唾液、組織和血清中的濫用藥物、毒品、農(nóng)藥和金屬毒物的提取，并可以與多種分析儀器聯(lián)合使用。如氣相色譜質(zhì)譜、高效液相色譜、紫外可見分光光度計、毛細(xì)管電泳等，成為通用性強的一種樣品前處理方法。由于DLLME的萃取劑多為有毒的氯代有機物，還存在一些環(huán)境污染問題，但隨著新的萃取劑如離子溶液、低濃度表面活性劑和新的有機低毒無毒萃取劑的出現(xiàn)，DLLME技術(shù)將在未來法庭毒物分析中擁有巨大的應(yīng)用潛力。