丙硫氧嘧啶聯(lián)合丹梔復(fù)方治療甲狀腺功能亢進合并妊娠小鼠對其子代甲狀腺功能的影響

包春燕， 周林裕， 于曉霞， 李彩霞

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院，陜西漢中 723000）

甲狀腺功能亢進（以下簡稱“甲亢”）是臨床上較為常見的一種疾病，發(fā)病率較高。其病因主要是由于機體甲狀腺激素分泌過多，引起機體自身代謝升高。甲亢為特異性自身免疫性疾病，女性發(fā)病率更高[1-3]。甲亢是妊娠期女性?；嫉募膊。瑫ψ哟斐刹涣加绊?，如出現(xiàn)新生兒體質(zhì)量偏小、甲狀腺功能異常，甚至?xí)霈F(xiàn)早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、畸形等情況。甲亢臨床表現(xiàn)有高代謝癥候、眼突出、彌漫性甲狀腺腫等。目前尚無研究確切地闡述其發(fā)病機理，其治療主要依靠抗甲狀腺藥物治療和手術(shù)治療[4]。抗甲狀腺藥物的作用可逆，不損害甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)，也不造成永久性甲狀腺功能減退。丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）作為一種常見的抗甲狀腺藥物，通過減少血液中T4向T3的轉(zhuǎn)化，有效控制母體的甲狀腺激素含量，達到治療效果[5]，但其對胎兒的影響尚缺乏相關(guān)的研究和結(jié)論。另外，大量臨床研究表明，中醫(yī)藥復(fù)方制劑可有效緩解甲亢患者的臨床癥狀。為探究PTU及聯(lián)合中藥制劑（選擇自擬丹梔復(fù)方）治療甲亢后對胎兒的影響，本研究以小鼠為研究對象，觀察其療效及對子代小鼠甲狀腺功能的調(diào)節(jié)作用，以期為臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級C57/BL6雌性小鼠150只，體質(zhì)量（19.11±1.36）g，鼠齡8周；SPF級C57/BL6雄性小鼠50只，體質(zhì)量（20.14±1.55）g，鼠齡8周。均由湖北省疾病控制中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。養(yǎng)殖環(huán)境溫度為（25.0±1.0）℃，濕度為70%～85%。所有小鼠狀態(tài)良好，精神狀態(tài)穩(wěn)定，無撕咬、爭斗、攻擊行為。本研究中動物實驗經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會同意，所有操作符合標準。

1.2 藥物與制備 丹梔復(fù)方組成：牡丹皮15 g，梔子12 g，柴胡12 g，蒼術(shù)12 g，地骨皮12 g，白芍10 g，當歸10 g，白術(shù)10 g，生姜5 g，甘草6 g，柏子仁15 g，薄荷8 g，麥冬15 g，鉤藤12 g，酸棗仁16 g。各中藥材均購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院藥房。將上述中藥材加500 mL蒸餾水，文火煎煮，取汁150 mL，備用[6]。按照人與動物間體表面積等效表[7]換算出小鼠丹梔復(fù)方劑量為11.0 g·kg-1·d-1（設(shè)定人的體質(zhì)量為70 kg，體表面積單位質(zhì)量用藥量的折算系數(shù)為9.1）。丙硫氧嘧啶片購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院藥房。

1.3 試劑與儀器 Ad-TSHR289/6xHis腺病毒，購自上海吉瑪生物公司（中國），由公司定制，無產(chǎn)品型號；總?cè)饧谞钕僭彼幔═T3）、總甲狀腺素（TT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）測定試劑盒購自南京建成生物公司（中國），序號分別為H224、H225、H222、H223；60 000 cpm 的125I-反三碘甲狀腺原氨酸（rT3），60 000 cpm的125I-T4，160 000 cpm的125I-T3，質(zhì)量濃度為10 μg/mL的T3標準品2 mL，濃度為10 μg/mL的T4標準品2 mL，質(zhì)量濃度為10 μg/mL的rT3標準品2 mL均購于北京北方生物技術(shù)研究所（中國），定制產(chǎn)品，無產(chǎn)品型號。Multiskan酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Aquaplore 3超級純水儀（美國艾科浦國際有限公司）；BSA423S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；5424R離心機（德國Eppendorf公司）。

1.4 造模 實驗小鼠適應(yīng)7 d后，隨機抽取120只雌性小鼠進行造模處理，剩下30只雌性小鼠設(shè)為正常組。于小鼠腿部注射腺病毒Ad-TSHR289/6xHis（滴度為1×1010顆粒/50 μL）免疫建立甲亢模型，每3周免疫1次，總共免疫3次。判斷甲亢模型造模成功的標準為：FT4和FT3水平顯著増高，甲狀腺組織有彌漫性甲狀腺腫伴或不伴促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）降低[6]。故檢測各組小鼠造模前后的FT4、FT3水平，以判斷造模成功與否。

1.5 分組與給藥 將造模成功的雌性小鼠分為4組：空白組，模型組，PTU組，PTU+丹梔復(fù)方組。各組分別與正常同齡雄性小鼠按雌雄比2∶1合籠配對，經(jīng)過2次合籠，每次合籠時間為2 d，剔除11只未受孕的雌性小鼠。發(fā)現(xiàn)雌鼠陰道栓則視為妊娠第1天，繼續(xù)飼養(yǎng)并分別給PTU組、PTU+丹梔復(fù)方組灌胃PTU懸濁液4.0 mg·kg-1·d-1、丹梔復(fù)方11.0 g·kg-1·d-1+PTU 4.0 mg·kg-1·d-1。從受孕成功開始持續(xù)給藥16 d，觀察直至分娩，分娩后母乳喂養(yǎng)，獲得分娩后3周的母鼠和子鼠。模型組、空白組小鼠灌胃等量生理鹽水，采用同樣的方法和飼養(yǎng)環(huán)境獲得母鼠和子鼠。觀察子鼠的基本情況，統(tǒng)計不良妊娠發(fā)生率（=不良妊娠/總親本數(shù)）。流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等非正常分娩行為則被判定為不良妊娠發(fā)生。雄性小鼠在配對前血清中FT3和FT4平均水平分別為（5.18±1.03）fg/mL和（18.86±5.14）fg/mL。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測小鼠甲狀腺激素水平 小鼠分娩后，于3周齡時空腹24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg體質(zhì)量）麻醉小鼠。摘眼球采集血液，抗凝靜置2 h后，以3 000 r/min的速度離心15 min。取上清液，采用ELISA法檢測甲狀腺激素 TT3、TT4、FT3、FT4的水平。根據(jù) TT3、TT4、FT3、FT4試劑盒說明書稀釋濃度梯度標準品，繪制標準曲線。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40 μL，然后再加生物素標記的抗體10 μL。將樣品加于酶標板孔底部。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔不加。封板室溫靜置30 min。將濃縮洗滌液用蒸餾水后備用。去封板膜，棄液體，每孔以上述洗滌液重復(fù)洗滌5次，加入顯色液，37℃避光顯色10 min，加終止液50 μL，終止反應(yīng)。用酶標儀讀取吸光度后，根據(jù)標準曲線計算TT3、TT4、FT3、FT4的質(zhì)量濃度。

1.7 采用放射免疫法測量脫碘酶的活性 取小鼠肝臟，加入1 mL緩沖液（0.01 mol/L的PBS，1 mmol/LDTT，2mmol/LEDTA，pH=7），4℃10000 r/min速度離心20 min，取上清液用Bradford蛋白測定法定量蛋白含量；分別以125I-rT3、125I-T4、125I-T3為底物，根據(jù)免疫反應(yīng)，測定上清液中的Ⅰ型脫碘酶（ID1）、Ⅱ型脫碘酶（ID2）、Ⅲ型脫碘酶（ID3）的活性。

1.8 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，多組比較采用多因素方差分析法，2組比較采用t檢驗，百分比數(shù)據(jù)采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后雌性親本小鼠FT3、FT4水平比較 表1結(jié)果顯示：造模前，造模組小鼠甲狀腺激素FT3、FT4水平與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；造模后，造模組小鼠FT3、FT4水平均較造模前升高，且顯著高于正常組（P＜0.05）。表明造模成功。

2.2 各組母鼠不良妊娠發(fā)生率、子鼠體質(zhì)量比較 表2結(jié)果顯示：空白組無不良妊娠發(fā)生。模型組發(fā)生8例不良妊娠，不良妊娠發(fā)生率為33.33%。與空白組比較，模型組母鼠不良妊娠發(fā)生率升高，子鼠體質(zhì)量降低（均P＜0.05）；與模型組比較，PTU組和PTU+丹桅復(fù)方組母鼠不良妊娠發(fā)生率降低，子鼠體質(zhì)量升高（均P＜0.05），且PTU+丹桅復(fù)方組對其改善作用優(yōu)于PTU組。

表1 造模前后雌性親本小鼠FT3、FT4水平比較Table 1 Comparison of the levels of FT3and FT4 in the of female parent mice before and after modeling[-x±s，ρ/（fg·mL-1）]

表2 各組母鼠不良妊娠發(fā)生率、子鼠體質(zhì)量比較Table 2 Comparison of the rate of abnormal pregnancy in female mice and the body mass of offspring mice in various groups

2.3 各組子鼠甲狀腺激素水平比較 表3結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組子鼠血清TT3、TT4、FT3、FT4含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，PTU組和PTU+丹梔復(fù)方組子鼠的TT3、TT4、FT3、FT4水平均顯著降低（P ＜ 0.05），且PTU+丹梔復(fù)方組對子鼠TT3、TT4、FT3、FT4水平的降低作用優(yōu)于PTU組（P＜0.05）。

2.4 各組子鼠脫碘酶活性比較 表4結(jié)果結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組子鼠ID1、ID2水平均顯著升高，ID3水平顯著降低（均P＜0.05）；與模型組比較，PTU組和PTU+丹梔復(fù)方組子鼠ID1、ID2水平均顯著降低，ID3水平顯著升高（均P＜0.05），且PTU+丹梔復(fù)方組對子鼠ID1、ID2、ID3的改善作用優(yōu)于PTU組（P＜0.05）。

表3 各組子鼠血清TT3、TT4、FT3、FT4含量比較Table 3 Comparison of the serum contents of TT3，TT4，F(xiàn)T3and FT4 in the offspring mice in various groups (-x±s)

表4 各組子鼠脫碘酶活性比較（-x±s）Table 4 Comparison of the activity of deiodinases in the offspring mice in various groups[（pmoL125I/mg protein-1·min-1）

3 討論

甲狀腺是機體最重要的腺體之一，妊娠期的大量生理活動都和甲狀腺激素的調(diào)控息息相關(guān)。甲狀腺激素有三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）2種主要形式，機體中的甲狀腺激素多以T4的形式貯存，而T3量雖然較少，生物活性卻比T4強得多[8]。當機體缺少甲狀腺激素時，體內(nèi)貯存的T4則通過脫碘酶的作用將T4轉(zhuǎn)化為活性更強的T3。T4可以經(jīng)過ID1和ID2的外環(huán)脫碘，形成T3，或者由ID1或者ID3的內(nèi)環(huán)脫碘后，轉(zhuǎn)化成不具有生物活性的反3，3’，5’-三碘甲狀腺原氨酸（rT3），最終由ID1或ID2多次催化脫碘，形成不含碘的物質(zhì)，代謝出機體外。ID1是唯一一種既可以催化內(nèi)環(huán)脫碘，又可以外環(huán)脫碘的酶，是機體中催化T4向T3轉(zhuǎn)化的主要脫碘酶，這種途徑也是機體保證T3含量的主要來源[9-11]。機體內(nèi)甲狀腺激素水平和脫碘酶的含量指示了甲狀腺功能的狀態(tài)。3種脫碘酶在機體中共同調(diào)整甲狀腺激素的相互轉(zhuǎn)化，保持機體的甲狀腺激素水平平衡。PTU治療甲亢的主要機制是通過阻止T4向T3轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)減弱具有生物活性的甲狀腺激素含量[4]。

在本研究中，妊娠小鼠采用PTU聯(lián)合丹梔復(fù)方治療，可糾正甲狀腺功能過于活躍的現(xiàn)象，顯著降低妊娠小鼠的甲狀腺激素水平，且子代小鼠發(fā)育正常。同時，PTU+丹梔復(fù)方組的子代小鼠ID1、ID2含量顯著降低，ID3活性顯著升高。提示PTU聯(lián)合丹梔復(fù)方治療妊娠小鼠，不僅降低妊娠小鼠的甲狀腺激素水平，而且加速甲狀腺激素的代謝，保持正常的甲狀腺激素水平，并顯著降低了不良妊娠的發(fā)生率。但其藥理還需要進一步研究。綜上所述，PTU聯(lián)合丹梔復(fù)方治療妊娠合并甲亢的小鼠有顯著效果，對子代小鼠的甲狀腺激素水平有重要調(diào)節(jié)作用，使子代小鼠甲狀腺水平趨于正常水平，顯著降低子代的不良妊娠發(fā)生率。