化瘀祛痰方對高脂血癥大鼠心功能及脂質(zhì)代謝的影響

杜瑩， 賈連群， 冷雪， 呂美君， 吳瑾， 陳麗娟

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實驗室，遼寧沈陽 110032）

高脂血癥是臨床上多種常見疾病的重要危險因素，同時也是引發(fā)臨床高危險疾病，增加死亡率的獨(dú)立因素[1]。祖國醫(yī)學(xué)并無高脂血癥之名，但卻有“膏”、“脂”之說[2]，認(rèn)為此類疾病多屬脾失健運(yùn)，膏脂生化轉(zhuǎn)運(yùn)失常，聚而為痰，日久壅滯營血，痰瘀互結(jié)，而成血脈痰瘀之患，常治以化瘀祛痰之法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以化瘀祛痰立法的化瘀祛痰方可以顯著改善高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)損傷情況[3]。而既往研究表明，動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心力衰竭形成、發(fā)展和惡化的主要原因，高脂血癥導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常是動脈粥樣斑塊形成的基礎(chǔ)[4]。因此，本研究擬通過建立高脂血癥大鼠模型，進(jìn)一步探討化瘀祛痰方對其心臟功能及脂質(zhì)代謝的影響?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 健康SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。動物房溫度為（20.80±2.97）℃，空氣相對濕度為（47.30±15.31）%。高脂飼料質(zhì)量分?jǐn)?shù)配方：10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%蔗糖、81.3%基礎(chǔ)飼料。飼料由沈陽市于洪區(qū)前民動物飼料廠提供。

1.2 藥物 化瘀祛痰方為國家發(fā)明專利藥物（專利號：ZL200710010845.9），全方由黨參25 g、黃芪25 g、茯苓10 g、法半夏5 g、絞股藍(lán)15 g、石菖蒲5 g、川芎5 g、丹參5 g、郁金5 g組成，以上藥物均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。所有藥材浸泡1 h后，經(jīng)武火煮沸，文火續(xù)煮20 min，過濾，重復(fù)煮3次，合并濾液，制成水煎劑，4℃冷藏；辛伐他汀片由魯南貝特制藥有限公司提供（批號：43160506）。

1.3 試劑與儀器 甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒由四川邁新生物技術(shù)有限公司提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號：37B00150；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠試劑盒由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號：37K00130；兔抗大鼠膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP）、肝脂酶（HL）單克隆抗體由愛必信（上海）生物科技有限公司提供，批號分別為AB02271548G、YE1026W。全自動生化分析儀（日本東芝公司）；Vevo2100超高分辯率小動物超聲影像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司）；FluorChem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國Proteinsimple公司）。

1.4 動物分組、造模與藥物干預(yù) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常組、模型組、化瘀祛痰組和辛伐他汀組，每組10只。正常組給予普通飼料，模型組、化瘀祛痰組和辛伐他汀組大鼠給予高脂飼料喂飼，共喂飼12周，復(fù)制高脂血癥模型[5]。造模結(jié)束后，按人和動物體表面積折算系數(shù)換算給藥劑量[6]，化瘀祛痰方組給予化瘀祛痰方藥（劑量為16.0 g·kg-1·d-1）灌胃，辛伐他汀組給予辛伐他?。▌┝繛?.0 mg·kg-1·d-1）灌胃，日1次，正常組和模型組予等體積生理鹽水（8.0 mL·kg-1·d-1）灌胃，連續(xù)給藥30 d。

1.5 指標(biāo)檢測與方法

1.5.1 心功能檢測 大鼠誘導(dǎo)麻醉后，將其鼻部置于鼻套中吸入體積分?jǐn)?shù)2%異氟烷氣（異氟烷∶氧氣=2∶1），仰臥位固定。待翻正反射消失后，胸部予脫毛膏脫毛備皮，涂耦合劑，小動物超聲探頭（250 mHz）置于大鼠左前胸，連接超聲檢查儀，進(jìn)行超聲檢查。測量左室收縮末期直徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening fraction，LVFS）等變化情況。

1.5.2 血脂檢測 末次給藥結(jié)束后空腹12 h，于次日清晨麻醉，腹主動脈采血5 mL。靜置1～2 h，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，取上清液，4℃保存。全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量。

1.5.3 Western blot法檢測肝組織中CETP、HL蛋白表達(dá) 加入蛋白裂解液提取各組肝臟組織蛋白，利用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。以60 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入CETP/HL及β-actin一抗，4℃封閉過夜。TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗。按1∶1比例配制化學(xué)發(fā)光液，將膜放在曝光板上，膜上滴適量的發(fā)光液，應(yīng)用全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)曝光分析圖片。數(shù)據(jù)結(jié)果以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值（p）表示。

1.6 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異（LSD）法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟功能變化情況 表1、圖1結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組LVESD、LVEDD顯著增大，LVEF、LVFS顯著減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表明模型組大鼠左心功能明顯降低。與模型組比較，化瘀祛痰組大鼠LVESD、LVEDD顯著縮小，LVEF、LVFS顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組大鼠LVEDD縮小，LVEF顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），LVESD亦縮小，LVFS亦升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心臟功能變化比較Table 1 Comparison of the cardiac function indexes in various groups (-x±s)

圖1 各組大鼠左心室M型超聲心動圖比較Figure 1 Comparison of the left ventricular M-type ultrasonic cardiogram in various groups

2.2 各組大鼠血脂情況 表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，化瘀祛痰組大鼠血清TG、TC水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.01）。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of TG，TC，HDL-C and LDL-C in various groups[-x±s，c/（mmol·L-1）]

圖2 各組大鼠肝臟CETP、HL蛋白表達(dá)比較Figure 2 Comparison of the expression levels of CETP and HL in liver tissues of various groups

2.3 各組大鼠肝臟CETP、HL蛋白表達(dá)比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肝臟CETP蛋白表達(dá)水平升高，HL蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與模型組比較，化瘀祛痰組和辛伐他汀組肝臟CETP蛋白表達(dá)水平降低，HL蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）。

3 討論

血脂異常多伴有多種心血管危險因素，心血管疾病的發(fā)生率和死亡率會隨著血清TC的下降而降低，而血清TC及TG的增加則會加劇動脈粥樣硬化的形成、發(fā)展，增加心力衰竭的發(fā)展及惡化的風(fēng)險[7]。冠心病患者多因冠狀動脈粥樣硬化而致心肌組織纖維化，左室增厚，LVEDD增大，從而影響心臟收縮和舒張功能，故認(rèn)為冠心病患者多存在心功能的改變[8]。然而冠心病早期并無明顯的心功能減退癥狀，往往受到人們的忽視，因此對于心功能減退如何早期發(fā)現(xiàn)并預(yù)防其發(fā)展至心衰是臨床中亟待解決的問題[9]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，高脂血癥的發(fā)病機(jī)理以脾、肝、腎三臟功能失調(diào)為主，多因飲食不節(jié)或過食肥甘而傷脾，脾虛失運(yùn)，津液內(nèi)停，聚而生痰，由痰致瘀，故痰瘀互結(jié)而發(fā)病。正如《本草經(jīng)疏》中記載：“飲啖過度，好食油面豬脂，濃厚膠固，以致脾氣不利，壅滯為患，皆痰所為?！碧岛宛鲋g存在著因果關(guān)系，貫穿高脂血癥的病程始終[10]，從“痰瘀同治”角度出發(fā)來防治高脂血癥有廣闊的前景。本研究所用的化瘀祛痰方為國家專利藥物，由黨參、黃芪、茯苓、法半夏、絞股藍(lán)、石菖蒲、川芎、丹參、郁金等組成，具有活血、化瘀、祛痰的作用，多用于痰瘀互結(jié)型的動脈粥樣硬化的治療，并在臨床上取得了滿意的療效[11]。本研究結(jié)果顯示，高脂血癥大鼠存在不同程度的血脂異常及心功能減退，化瘀祛痰方能顯著降低高脂血癥大鼠的TC、TG水平，縮小LVESD、LVEDD，升高LVEF及LVFS，說明化瘀祛痰方在降低血脂水平的同時，也改善了大鼠的心臟功能。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，化瘀祛痰方能夠從多個方面對高脂血癥大鼠肝臟脂質(zhì)損傷起到保護(hù)作用[12，13]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，化瘀祛痰方能降低高脂血癥大鼠肝臟CETP、HL蛋白的表達(dá)。CETP與HL均是與心血管疾病密切相關(guān)的蛋白，它們都在脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用。CETP能將膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)移到LDL-C和VLDL上，從而降低了HDL-C濃度，使CETP產(chǎn)生了致動脈粥樣硬化作用。HL能水解脂蛋白中的TG和磷脂，其主要功能是降低血脂水平，HL對調(diào)節(jié)血脂、防治動脈粥樣硬化有重要意義[14]。

目前，他汀類藥物具有降脂作用已經(jīng)得到肯定，這類藥可通過競爭性、選擇性地抑制膽固醇及肝臟羥甲基戊二酰輔酶還原酶的合成，從而降低血漿中膽固醇含量，改善血液流變學(xué)指標(biāo)水平，促使動脈粥樣硬化逆轉(zhuǎn)，改善心肌血循環(huán)，增強(qiáng)患者心功能[15]。本研究選用辛伐他汀作為陽性對照藥。研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀在穩(wěn)定降低血脂水平的同時，可以下調(diào)CETP蛋白表達(dá)，上調(diào)HL蛋白表達(dá)，還可縮小LVEDD，提升LVEF值，從而改善了心臟功能，而左室LVESD，雖有縮小趨勢，以及LVFS略有升高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。出現(xiàn)此結(jié)果考慮與樣本含量有限有關(guān)，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究以高脂血癥大鼠為研究對象，探討化瘀祛痰方對高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白和心功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化瘀祛痰方既可降低血脂水平，也可改善高脂血癥大鼠的心臟功能，為化瘀祛痰方的治療范圍提供了一定的實驗依據(jù)。