流式細(xì)胞術(shù)工業(yè)生產(chǎn)中有關(guān)細(xì)菌檢測(cè)的應(yīng)用

王 丹 王少鵬 馮軍超 徐興魯 邢立超

山東新創(chuàng)生物科技有限公司 山東 濟(jì)南 250101

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)從20 世紀(jì)60 年代后期創(chuàng)建以來,發(fā)展迅速,最初主要用于科學(xué)研究和臨床試驗(yàn)[1],在微生物領(lǐng)域應(yīng)用較少,并且起步相對(duì)較晚,但是近年來,在國外流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的相關(guān)檢測(cè),而國內(nèi)在這方面的應(yīng)用則較少。

并且,隨著電子、激光、計(jì)算機(jī)等方面的快速發(fā)展與進(jìn)步,流式細(xì)胞儀也在不斷完善與更新,如今流式細(xì)胞儀已經(jīng)在微生物檢測(cè)中扮演著越來越重要的角色。微生物中,特別是細(xì)菌,在生產(chǎn)或研究中往往需要對(duì)其進(jìn)行快速測(cè)定,并且也需要也對(duì)細(xì)菌數(shù)量、大小、活性等進(jìn)行多參數(shù)分析,而流式細(xì)胞儀自身的特性恰好符合這樣的檢測(cè)需求[2]。目前,已經(jīng)有較多相關(guān)檢測(cè)方法的報(bào)道,本文中主要從細(xì)菌計(jì)數(shù)、無菌檢查、生產(chǎn)在線監(jiān)測(cè)等幾個(gè)方面,介紹流式細(xì)胞儀在工業(yè)生產(chǎn)中細(xì)菌檢測(cè)相關(guān)應(yīng)用。

1 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及工作原理

流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般可以分為5個(gè)部分,包括流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、激光光源及光束形成系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)顯示儲(chǔ)存分析系統(tǒng)、細(xì)胞分選系統(tǒng)。

將待測(cè)樣本制備成單細(xì)胞懸液,經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中,在氣體的壓力下,進(jìn)入充滿流動(dòng)的鞘液。當(dāng)鞘液壓力和樣品壓力達(dá)到一定程度的壓差,在鞘液的約束下細(xì)胞排列成單列,由流動(dòng)室的噴嘴流出,形成細(xì)胞注經(jīng)過激光聚焦區(qū),與入射的激光束垂直想交,經(jīng)特異的熒光染料染色的細(xì)胞被激光激發(fā)產(chǎn)生特定波長的熒光。儀器中一系列光學(xué)系統(tǒng),收集熒光等光學(xué)信號(hào),由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行收集、存儲(chǔ)、顯示并分析被檢測(cè)到的各種信號(hào),對(duì)各種指標(biāo)做出統(tǒng)計(jì)分析[3]。

2 FCM 在細(xì)菌計(jì)數(shù)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法為微生物平板計(jì)數(shù)法或者顯微鏡計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),雖然這種計(jì)數(shù)方法適用范圍廣,但是也存在較多難以克服的缺點(diǎn),如時(shí)間長、操作步驟復(fù)雜、工作量大等,并且微生物平板計(jì)數(shù)法僅能對(duì)活菌計(jì)數(shù),對(duì)于失去活性的細(xì)菌則無法計(jì)數(shù)。

而流式細(xì)胞術(shù),可以克服傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法耗時(shí)長、操作步驟繁瑣等問題,并且可以區(qū)分出細(xì)菌的死活,并進(jìn)行定量分析。王銀環(huán)等[4]使用BD FASS Microcount檢測(cè)了3種地衣芽孢活菌制劑中的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率,測(cè)定過程簡單、便捷、快速,并且與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法相比無顯著性差異,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠；汪沐等[5]建立了熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合(FISH-FCM)快速測(cè)定肉食品中腸桿菌的方法,與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法相比,極大的縮短了檢測(cè)時(shí)間,并且該方法的檢出率為100%,適用性較強(qiáng)；姜?jiǎng)P[6]構(gòu)建了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳酸菌數(shù)量的方法,通過使用PI(碘化丙錠)和SYTO?24兩種熒光染料對(duì)死菌和活菌染色,對(duì)10多個(gè)批次的發(fā)酵劑、發(fā)酵乳飲料、發(fā)酵乳等產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè),與現(xiàn)行國標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比,并無顯著性差異,且重現(xiàn)性好、單個(gè)樣品檢測(cè)時(shí)間不超過5min,極大的縮短了檢測(cè)周期,克服了檢測(cè)嚴(yán)重滯后于生產(chǎn)過程的難題。

此外,劉春春等[7]在對(duì)枯草芽孢桿菌的多態(tài)異質(zhì)性分析中,使用BD Influx(spo),對(duì)50nm～500nm 標(biāo)準(zhǔn)尺寸微球進(jìn)行靈敏度分析,結(jié)果顯示在對(duì)300nm 以上的微粒均具有較高的靈敏度,這解決了細(xì)菌休眠體芽孢等小微粒難以精確分析的難題,促進(jìn)了流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步發(fā)展。

3 FCM 在無菌檢測(cè)中的應(yīng)用

在藥品生產(chǎn)中,微生物無菌檢查是控制保證藥品質(zhì)量的關(guān)鍵因素,是生產(chǎn)中必不可少的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。各國藥典中的無菌檢查方法均是通過觀察培養(yǎng)基培養(yǎng)后的混濁情況來判斷產(chǎn)品的無菌情況,此方法同樣具有檢測(cè)周期長、操作過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。

近些年來,國內(nèi)外已經(jīng)有出現(xiàn)較多新興方法進(jìn)行無菌檢查,由于檢測(cè)時(shí)間快、靈敏度高,流式細(xì)胞術(shù)也較多的用于無菌檢查。宋光艷等[8]使用SYTO9熒光染料對(duì)藥品中的微生物進(jìn)行熒光標(biāo)記后,采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩種類型(溶液和無菌粉末)注射劑檢測(cè),檢出限均＜10CFU,與藥典法相比,檢出時(shí)間比常規(guī)方法縮短40%～70%,可作為法定檢查方法的有效補(bǔ)充；Mohr H 等[9]使用噻唑橙熒光染料對(duì)10余種細(xì)菌進(jìn)行熒光標(biāo)記后,使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)PCs(血小板濃縮物)進(jìn)行檢測(cè),研究顯示,在接種大約1CFU/m L的細(xì)菌,37℃孵育的條件下,多數(shù)種類細(xì)菌在21小時(shí)內(nèi)或更短的時(shí)間內(nèi)可以被檢測(cè)到；盧昕等[10]采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)接處鏡護(hù)理液進(jìn)行無菌檢查,結(jié)果顯示當(dāng)污染量在1～109CFU 范圍時(shí),可直接得出含菌量,同時(shí)可有效縮短檢出時(shí)間。

此外,也有許多其它檢測(cè)方法用于無菌檢查,如采用生物熱動(dòng)力學(xué)方法、Q-PCR 方法等[10],與傳統(tǒng)方法相比,均具有縮短檢測(cè)周期、操作流程簡單等特點(diǎn),這極大的提高了生產(chǎn)效率,加快了產(chǎn)品投入市場(chǎng)。

4 FCM 在生產(chǎn)在線監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

由于生產(chǎn)中終產(chǎn)品的的合格依靠于生產(chǎn)中各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制,因此在生產(chǎn)中實(shí)施在線監(jiān)測(cè)具有重要意義。

目前,國外已有研究人員采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)生產(chǎn)中在線監(jiān)測(cè)技術(shù)進(jìn)行了探索。2000年設(shè)計(jì)了一種強(qiáng)大的流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)(FI-FCM),通過此檢測(cè)系統(tǒng)的在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng),得到了大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程的完整生長曲線[8]；亦應(yīng)用FI-FCM 流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng),通過頻繁采樣(每5min一次),實(shí)現(xiàn)在線、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器中微生物細(xì)菌的生長變化情況；應(yīng)用具有毫秒分辨率的RT-FCM(Real time Flow Cytometry)流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng),實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器中多樣微生物的高動(dòng)態(tài)發(fā)展過程,文中通過進(jìn)行4個(gè)不同微生物相關(guān)研究方向的實(shí)驗(yàn),證明此檢測(cè)系統(tǒng)在對(duì)各種生物實(shí)驗(yàn)的廣泛適用性和可以對(duì)具有復(fù)雜的生物過程如發(fā)酵等收集到更加詳細(xì)、時(shí)間上更加連續(xù)的信息,這也有助于工業(yè)生產(chǎn)中優(yōu)良菌株的篩選[3]。

而國內(nèi)還較少應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)生產(chǎn)過程進(jìn)行在線監(jiān)測(cè),更多是應(yīng)用在海洋生態(tài)系統(tǒng)中生物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[11],如果將FCM 更多的應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中,尤其是微生物發(fā)酵等過程,能夠更好地收集到菌體發(fā)酵多參數(shù)的信息,這對(duì)整個(gè)生產(chǎn)工藝過程的質(zhì)量控制具有重大意義。

總結(jié)

除了在工業(yè)生產(chǎn)中,流式細(xì)胞術(shù)也廣泛應(yīng)用于在科學(xué)研究、臨床檢測(cè)、生態(tài)環(huán)境等各個(gè)領(lǐng)域,尤其對(duì)一些微小粒子來說,其具有的逐個(gè)分析、靈敏、快速、多參數(shù)分析等優(yōu)勢(shì),更是受到了大家的青睞；雖然流式設(shè)備一般價(jià)格昂貴,前期成本較高,但是相信隨著科技的飛速發(fā)展,難題也將逐漸解決,流式細(xì)胞術(shù)也將有更加廣闊的應(yīng)用前景。