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    CYP3A5基因多態(tài)性對腎病患者他克莫司臨床應(yīng)用指導(dǎo)分析

    2019-07-12 10:19:16李曉琳中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心天津3006河北省人民醫(yī)院河北石家莊05005
    關(guān)鍵詞:克莫司血藥濃度腎小球

    李曉琳,劉 冰(.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心,天津 3006;.河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 05005)

    腎病是常見疾病的一種,發(fā)病多與免疫功能異常、炎癥反應(yīng)等有關(guān),可導(dǎo)致患者腎功能嚴(yán)重下降,甚至引發(fā)腎衰竭[1]。目前臨床上通常會通過免疫抑制劑對腎病患者進(jìn)行治療,他克莫司是常見的一種免疫抑制劑,此藥物療效有較大的個體化差異,患者對藥物反應(yīng)也完全不同,以常規(guī)的藥物濃度監(jiān)測來對藥物劑量進(jìn)行調(diào)整存在一定的局限性,難以有效預(yù)防藥品不良反應(yīng)的發(fā)生[2]。近年來,臨床上發(fā)現(xiàn)CYP3A5酶屬于他克莫司代謝的關(guān)鍵酶,基于此,臨床上多通過檢測CYP3A5基因多態(tài)性來對他克莫司的血藥濃度、不良反應(yīng)等進(jìn)行分析[3]。本研究對接受他克莫司治療的90 例腎病患者開展CYP3A5*3 多態(tài)性測定,探討CYP3A 5*3 多態(tài)性對他克莫司濃度、不良反應(yīng)的影響。

    1 資料與方法

    1.1 研究資料

    1.1.1 病例資料 此次共納入病例90 例,均為2016年6 月- 2017 年6 月在本院接受治療的腎病患者,均為漢族。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合難治性腎病綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)耐受他克莫司治療;(3)均很好的完成相應(yīng)的治療;(4)已配合簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他器官、系統(tǒng)疾病;(2)應(yīng)用他克莫司治療前1個月使用過其他免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物;(3)存在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素使用禁忌癥?;颊咝詣e:男性49例(54.44%),女性41例(45.56%);年齡:26 ~ 67歲,平均(46.53±7.65)歲。此次研究已通過本院醫(yī)學(xué)倫理會審批。

    1.1.2 實驗材料 (1)主要試劑:PuregeneDNA 提取試劑盒(德國Qingen 公司);無水乙醇(上海振興化工廠);PCR 試劑盒(德國Qingen 公司);引物合成購自上海英俊生物技術(shù)公司;DNA Marker、瓊脂糖、5×TAE緩沖液(北京鼎國生物技術(shù)有限公司);溴化乙淀(德國Boehringer Mannhein 公司)。(2)主要儀器:常溫離心機(jī)(上海醫(yī)用儀器廠);紫外分光光度儀、Master cycler PCR 儀(Eppendorf 公司);電泳儀(DYCP-31,北京六一儀器廠);血藥濃度監(jiān)測儀(美國Abbott公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 治療方法 90 例患者均給予他克莫司(福建科瑞藥業(yè)有限公司,批號:20160211)治療,劑量3 ~ 4 mg·kg-1·d-1,口服,bid。

    1.2.2 實驗方法 (1)他克莫司血藥濃度檢測:給藥12 h后,采集患者晨起空腹靜脈血液標(biāo)本,2 ~ 3 mL,常規(guī)抗凝處理,取200 μL血液標(biāo)本與200 μL樣本萃取液,置入離心管,搖晃5 ~ 10 s使其均勻,離心處理38 500 r·min-1,共5 min,取上清,置入化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng),測定血藥濃度。

    (2)CYP3A5基因多態(tài)性測定:①外周血DNA提?。翰杉颊叱科鹂崭轨o脈血液標(biāo)本3 mL,對外周血基因組DNA進(jìn)行提取:在1.5 mL EP管中加入20 μL蛋白酶K,并加入200 μL全血標(biāo)本與200 μL裂解液,行15 s漩渦混勻處理,置入56 ℃水浴箱,進(jìn)行10 min孵育,瞬時離心。將200 μL乙醇加入,行15 s 漩渦混勻處理,瞬時離心,將以上內(nèi)容轉(zhuǎn)移至2 mL收集管中,離心處理8000 r·min-1,1 min,去除濾液。在新收集管內(nèi)加入500 μL 裂解液,離心處理14 000 r·min-1,3 min,去除濾液,轉(zhuǎn)移至另一收集管,離心14 000 r·min-1,1 min。在1.5 mL離心管中置入收集管圓柱,去除濾液,加入200 μL蒸餾水,置于室溫下5 min,離心處理8000 r·min-1,1 min,去除濾液即可得到DNA。通過紫外分光光度法對DNA濃度進(jìn)行測定。②DNA的OD 值測定:取DNA 提取液5 μL,加入195 μL 純水進(jìn)行稀釋處理,通過紫外分光光度計對OD值進(jìn)行測定。③CYP3A5基因多態(tài)性檢測:通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物分析技術(shù)對基因進(jìn)行擴(kuò)增,在PCR管中置入25 μL工作液、3 μL DNA,混勻。在引物板每孔中加入10 μL以上混合液,將15 ~ 20 μL石蠟油加入,封板。循環(huán)參數(shù):96 ℃ 2 min,96 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,共循環(huán)5次;96 ℃ 20 s,65 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,共進(jìn)行10個循環(huán);96 ℃ 20 s,63 ℃ 45 s,72 ℃ 30 s,共循環(huán)15次;72 ℃ 2 min。對循環(huán)末的熒光信號進(jìn)行收集,并展開溶解曲線分析。

    1.3 結(jié)果判定

    對每個孔的Ct 值、特征性熔解曲線導(dǎo)數(shù)峰進(jìn)行記錄,Ct 值在10 以上,22 及以下,或D(1)/D(2)在1.5及以下為陽性;Ct在22以上,或者D(1)/D(2)在1.5以上為陰性。1孔陽性,2孔陰性為*1/*1型;1孔、2孔均為陽性為*1/*3型;1孔陰性,2孔陽性為*3/*3型。

    1.4 觀察指標(biāo)

    (1)90 例患者CYP3A5 基因類型。(2)不同基因型患者用藥后1 個月、6 個月、12 個月時的血藥濃度、日劑量、血藥濃度與日劑量比值(血藥濃度/日劑量)。(3)不同基因型患者不良反應(yīng)發(fā)生情況,主要包括肝損傷、高血糖、血液毒性、高血壓、胃腸道反應(yīng)等他克莫司引發(fā)的不良反應(yīng)。(4)CYP3A5基因多態(tài)性與他克莫司不良反應(yīng)的相關(guān)性。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 患者基因類型

    90例患者中,21例為*1/*1型(23.33%),29例為*1/*3型(32.22%),40例為*3/*3型(44.44%)。

    2.2 不同基因型患者血藥濃度

    用藥后1 個月、6 個月、12 個月,*1/*1 型、*1/*3型患者血藥濃度、血藥濃度/日劑量均較*3/*3型患者低,且*1/*1型、*1/*3型日劑量較*3/*3型患者高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05),見表1。

    2.3 不同基因類型患者不良反應(yīng)發(fā)生情況

    *1/*1 型、*1/*3 型患者不良反應(yīng)發(fā)生率較*3/*3型患者低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05),見表2。

    2.4 CYP3A5基因多態(tài)性與他克莫司不良反應(yīng)的相關(guān)性

    90 例患者,共27 例發(fā)生不良反應(yīng),對其不良反應(yīng)可能的影響因素展開單因素分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)生不良反應(yīng)者與未發(fā)生者在性別、年齡、尿蛋白定量、血清肌酐方面,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05),發(fā)生不良反應(yīng)者血藥濃度較未發(fā)生者高,發(fā)生不良反應(yīng)患者的*3/*3型基因所占比例較未發(fā)生者高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05),見表3。

    依據(jù)表3,以平均血藥濃度、*1/*1 型、*1/*3 型、*3/*3 型基因為變量展開Logistic 回歸分析,發(fā)現(xiàn)*3/*3型CYP3A5 基因是導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生的主要影響因素,見表4。

    3 討論

    他克莫司是腎小球疾病治療的主要藥物,此藥物能夠與細(xì)胞受體進(jìn)行結(jié)合,促使靶細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化、鈣離子通道信息傳遞改變,進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用,達(dá)到改善疾病的效果[4]。他克莫司進(jìn)入血液后,主要通過細(xì)胞色素P450酶系的CYP3A亞家族進(jìn)行代謝,不同個體對他克莫司的生物利用度存在較大差異性,因此腎小球疾病患者通過他克莫司治療的效果、安全性存在個體性[5]。以往臨床上多通過血藥濃度測定來確定他克莫司劑量,但此方法有一定局限性,無法實現(xiàn)他克莫司劑量的精準(zhǔn)控制。因此,近年來臨床上多對CYP3A5 基因多態(tài)性進(jìn)行分析,個體化用藥,以對他克莫司劑量進(jìn)行精準(zhǔn)化控制,在達(dá)到預(yù)期效果的同時,減少不良反應(yīng)的發(fā)生。CYP3A5主要表達(dá)于肝臟、腎臟、小腸中,其中肝內(nèi)占30%左右,腸內(nèi)占70%以上,參與藥物代謝的CYP3A 占60%以上。人體內(nèi)的CYP3A 亞型主要有CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7等,其中參與他克莫司代謝中的主要為CYP3A4、CYP3A5,CYP3A3水平高低直接影響他克莫司生物利用度[6]。

    近年來,關(guān)于基因多態(tài)性的研究不斷深入,臨床上越來越重視個體基因水平與藥物代謝之間的關(guān)聯(lián)性。大量臨床研究表明CYP3A5基因多態(tài)性直接影響他克莫司的血藥濃度,對腎小球疾病患者采用他克莫司進(jìn)行治療時,臨床上逐漸重視CYP3A5基因多態(tài)性檢測[7-8]。齊林等[9]關(guān)于CYP3A5 基因多態(tài)性與他克莫司血藥濃度相關(guān)性的研究以腎移植患者為對象,結(jié)果顯示*3/*3 型基因患者血藥濃度、術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生率最高。本次研究以腎小球疾病患者為研究對象,探討不同CYP3A5基因類型患者他克莫司血藥濃度與不良反應(yīng)發(fā)生情況,結(jié)果顯示,用藥后1 個月、6 個月、12個月,*1/*1型、*1/*3型患者血藥濃度、血藥濃度/日劑量均較*3/*3型患者低,且*1/*1型、*1/*3型日劑量均較*3/*3型患者高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。結(jié)果提示,若腎小球疾病患者口服相同劑量的他克莫司,*1/*1型、*1/*3型患者血藥濃度低于*3/*3型患者,為達(dá)到預(yù)期療效,1/*1型、*1/*3型患者需服用更多的劑量,才可達(dá)到與*3/*3型患者相同的血藥濃度。

    表1 不同基因型患者血藥濃度對比Tab 1 Comparison of blood concentration of patients with different genotypes

    表2 不同基因類型患者不良反應(yīng)發(fā)生情況對比.例(%)Tab 2 Comparison of adverse reactions in patients with different gene types. case(%)

    表3 90例患者不良反應(yīng)影響因素的單因素分析Tab 3 Univariate analysis of factors influencing adverse reactions in 90 patients

    表4 Logistic回歸分析結(jié)果Tab 4 Results of logistic regression analysis

    此外,本次研究結(jié)果還顯示,在不良反應(yīng)發(fā)生率方面,*1/*1型患者是19.05%,*1/*3型是24.14%,均較*3/*3 型的40.00%低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。CYP3A5 基因位于人類第7 號染色體,共包含外顯子13 個,長31.8 kb,屬于高度變異基因之一,突變點位較多,包括CYP3A5*2、CYP3A 5*3、CYP3A5*4 等,其中在各種族人群中發(fā)生頻率最高的是CYP3A5*3[10]。CYP3A5*3突變可導(dǎo)致CYP3A5 mRNA 出現(xiàn)可變性的剪切,生存不穩(wěn)定截斷蛋白質(zhì),因此攜帶CYP3A5*3/*3 基因的人體無法對存在酶活性的CYP3A5 蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá),此類人群便屬于他克莫司慢代謝型。采用他克莫司治療腎小球疾病時,CYP3A5*1/*1型基因患者有明顯的清除優(yōu)勢存在,可導(dǎo)致他克莫司代謝增加,使藥物暴露降低,因此藥品不良反應(yīng)較少。而CYP3A5*3/*3 型基因患者無法對他克莫司進(jìn)行充分性代謝,雖然僅需要低劑量的他克莫司即可達(dá)到血藥濃度,但不良反應(yīng)發(fā)生率較高。本次研究采用Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)*3/*3型CYP3A5基因是導(dǎo)致腎小球疾病患者接受他克莫司治療時發(fā)生不良反應(yīng)的主要影響因素。因此,建議臨床在采用他克莫司對腎小球疾病患者進(jìn)行治療時,可對患者CYP3A5基因多態(tài)性進(jìn)行檢測,依據(jù)檢測結(jié)果對他克莫司劑量進(jìn)行確定,以達(dá)到提升療效、降低不良反應(yīng)發(fā)生率的效果。

    綜上所述,CYP3A5基因多態(tài)性直接影響腎小球疾病患者他克莫司血藥濃度與不良反應(yīng),*3/*3 型患者血藥濃度、不良反應(yīng)發(fā)生率均高于*1/*1 型、*1/*3型患者。由于此次研究樣本量較小,僅開展回顧性研究,尚需增加樣本量展開大量研究,以進(jìn)一步探討CYP3A5基因多態(tài)性與腎小球疾病患者他克莫司血藥濃度、不良反應(yīng)的相關(guān)性。

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