體外與非體外循環(huán)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)對(duì)患者圍術(shù)期T細(xì)胞亞群及粒淋比影響的對(duì)比研究

郝 星，韓俊燕，王 紅，江春景，楊 峰，侯曉彤

冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）是冠心病患者的主要治療手段。目前國(guó)內(nèi)較大的心血管中心多數(shù)主要采用非體外循環(huán)冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)（off-pump coronary artery bypass grafting，OPCAB），然而，盡管 OPCAB 有避免心肺轉(zhuǎn)流（cardiopulmonary bypass，CPB）相關(guān)炎癥反應(yīng)、出血少、房顫發(fā)生率低等諸多優(yōu)勢(shì)，但仍可能出現(xiàn)術(shù)中心輸出量降低、液體超負(fù)荷及血管重建不足等問(wèn)題?；谳^大樣本量對(duì)比研究和薈萃分析［1-3］發(fā)現(xiàn)兩者術(shù)后的臨床預(yù)后差異并不顯著，因此，針對(duì)需要外科血管重建的冠心病患者，也有觀點(diǎn)傾向于支持采用CPB輔助下行冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)（on-pump coronary artery bypass grafting， ONCAB），而 ONCAB過(guò)程中CPB等所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)程度及對(duì)機(jī)體的影響也是臨床醫(yī)生需要權(quán)衡利弊的重要因素，所以選擇何種手術(shù)方式仍是存在較大爭(zhēng)議的問(wèn)題。

既往研究表明，在ONCAB過(guò)程中由于血液與CPB非生物相容性界面直接接觸引發(fā)多種免疫細(xì)胞參與的一系列炎性反應(yīng)，包括中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞［4］、單核細(xì)胞［5］亞群的激活及各種炎性因子［6-7］的釋放，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）變化等，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡，進(jìn)一步影響患者的預(yù)后。那么為了明確OPCAB手術(shù)期間T細(xì)胞亞群及NLR的變化，以及ONCAB是否會(huì)進(jìn)一步加重或者減輕這些免疫失衡，本研究擬通過(guò)對(duì)比觀察OPCAB及ONCAB手術(shù)的患者圍手術(shù)期外周血中T細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+及CD8+）的絕對(duì)計(jì)數(shù)、比例及 NLR的變化，研究OPCAB及ONCAB手術(shù)對(duì)患者圍術(shù)期T細(xì)胞各亞群及全身炎癥反應(yīng)的改變，從另一個(gè)視角來(lái)評(píng)估CPB對(duì)患者免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究于2016年6月至2016年12月納入首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院就診住院需擇期行CABG的冠心病患者共40例，其中接受OPCAB手術(shù)（OPCAB組）及ONCAB手術(shù)（ONCAB組）各20例患者。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：急診手術(shù)，合并患有惡性腫瘤、炎癥或感染，嚴(yán)重的左心室功能障礙（射血分?jǐn)?shù)＜30%）和腎功能不全或衰竭。本研究得到了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（2016018X），所有患者簽署了知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集 于麻醉前（pre），手術(shù)結(jié)束時(shí)（0 d），術(shù)后第1、2、3及4 d晨起6時(shí)分別采集患者抗凝（edetic acid，EDTA乙二胺四乙酸）血4 ml，進(jìn)行后續(xù)免疫檢測(cè)分析。

1.3 麻醉管理 手術(shù)均采用靜脈和吸入聯(lián)合麻醉，在咪唑安定、依托咪酯、羅庫(kù)溴銨及芬太尼誘導(dǎo)下氣管插管，控制呼吸。麻醉維持：持續(xù)泵注丙泊酚，間斷靜脈注射芬太尼、咪唑安定及阿曲庫(kù)銨。術(shù)中常規(guī)監(jiān)測(cè) ECG、經(jīng)皮血氧飽和度（SpO2）、BP、CVP、鼻咽溫和直腸溫等。

1.4 CPB管理 CPB預(yù)充液包括：1 000 ml聚明膠肽，500 ml勃脈力，20%甘露醇 0.25～0.5 mg／kg，5%NaHCO33～5 mmol／kg，肝素 1 mg／kg。 當(dāng)活化凝血時(shí)間達(dá) 480 s后，開(kāi)始轉(zhuǎn)機(jī)，灌注流量：2.2～2.4 L／（m2·min），轉(zhuǎn)中維持平均動(dòng)脈壓在50～80 mm Hg，紅細(xì)胞比容維持在0.20～0.25。經(jīng)升主動(dòng)脈根部順行灌注4∶1含血高鉀停搏液保護(hù)心肌。

1.5 手術(shù)流程 麻醉后常規(guī)消毒鋪巾，行胸骨正中切開(kāi)，全身肝素化（4 mg／kg），建立 CPB，通過(guò)順行灌注低溫心臟停搏液及心表局部覆冰降溫，來(lái)實(shí)現(xiàn)心臟停搏和心肌保護(hù)。在亞低溫（34～35℃）下進(jìn)行ONCAB手術(shù)。在常溫下進(jìn)行OPCAB，左乳內(nèi)動(dòng)脈和大隱靜脈移植物用于CABG患者的血運(yùn)重建。手術(shù)過(guò)程遵循標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)方案。術(shù)后應(yīng)用魚(yú)精蛋白中和肝素。

1.6 T細(xì)胞亞群比例及數(shù)目檢測(cè) 采用抗人CD3 FITC／CD8 PE／CD45 PerCP／CD4 APC 抗體（美國(guó)BD公司）結(jié)合絕對(duì)計(jì)數(shù)微球進(jìn)行染色，避光孵育15 min，采用FACS Lysing buffer（美國(guó)BD公司）裂解紅細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀FACS Calibur獲取和分析數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)（正態(tài)分布資料）或非參數(shù)檢驗(yàn)（非正態(tài)分布資料）比較不同分組患者T淋巴細(xì)胞各亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)及NLR變化差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般臨床資料對(duì)比分析 接受OPCAB或ONCAB手術(shù)的患者各納入20例，共計(jì)40例，患者一般臨床資料詳見(jiàn)表1。如表1所示，兩組患者基線數(shù)據(jù)［年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、白細(xì)胞（WBC）及術(shù)前射血分?jǐn)?shù)］無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究納入所有患者均順利出院。

2.2 兩組患者術(shù)后WBC、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及NLR的變化 根據(jù)白細(xì)胞表面CD45表達(dá)的差異（圖1），可將其分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。應(yīng)用流式檢測(cè)技術(shù)觀察兩組患者外周血WBC、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目的變化。

OPCAB組患者術(shù)后WBC迅速增多，術(shù)后2 d達(dá)到峰值，術(shù)后4 d逐漸恢復(fù)（圖2A）。應(yīng)用流式分析發(fā)現(xiàn)OPCAB術(shù)后中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在術(shù)后2 d內(nèi)顯著增加（圖2B），而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)下降直至術(shù)后2 d（圖2C）。與術(shù)前相比，OPCAB患者術(shù)后NLR明顯增加，術(shù)后2 d天逐漸回落（圖2D）。

ONCAB組與 OPCAB患者相比，圍術(shù)期的WBC，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致。兩組患者術(shù)后出現(xiàn)WBC、粒細(xì)胞增加，而淋標(biāo)及NLR的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致，各時(shí)點(diǎn)未見(jiàn)顯著差異（圖2A～2D）。

表1 行ONCAB和OPCAB患者的一般臨床資料

圖1 采用流式細(xì)胞儀對(duì)WBC、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞群進(jìn)行檢測(cè)分析

圖2 兩組圍術(shù)期各時(shí)點(diǎn)WBC、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及NLR動(dòng)態(tài)變化

2.3 兩組患者圍術(shù)期CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的變化 OPCAB 術(shù)后CD3+，CD4+，CD8+T細(xì)胞的計(jì)數(shù)顯著下降（圖3A～3C）。術(shù)后1 d降至最低，術(shù)后4 d恢復(fù)基線水平。此外，OPCAB術(shù)后CD4+與CD8+T細(xì)胞比值顯著增加（圖3D），1 d后降至正常。結(jié)果提示，OPCAB手術(shù)明顯降低外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)目。

ONCAB組與OPCAB組患者相比，其圍術(shù)期不同時(shí)間點(diǎn)T細(xì)胞各亞群變化趨勢(shì)相似，未發(fā)現(xiàn)兩組間存在顯著差異（圖3A～3D）。

圖3 兩組患者在不同時(shí)間點(diǎn)T細(xì)胞各亞群的變化差異

3 討 論

本研究對(duì)比觀察了OPCAB與ONCAB手術(shù)對(duì)患者T細(xì)胞各亞群及NLR的影響。研究發(fā)現(xiàn)：與術(shù)前相比，OPCAB手術(shù)引起患者外周血CD4+，CD8+T細(xì)胞亞群數(shù)目顯著下降，粒細(xì)胞明顯增多。進(jìn)一步，與接受ONCAB手術(shù)的患者相比，兩組患者術(shù)后中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞各亞群及NLR變化并未發(fā)現(xiàn)存在顯著差異。因此，OPCAB手術(shù)本身亦會(huì)激發(fā)患者出現(xiàn)一系列炎癥反應(yīng)，影響患者免疫功能，而ONCAB手術(shù)期間的CPB并未加重T細(xì)胞各亞群及NLR的改變。

ONCAB與OPCAB手術(shù)在CABG中的利弊爭(zhēng)議已經(jīng)持續(xù)了幾十年。既往研究主要從臨床結(jié)局、手術(shù)本身以及炎癥反應(yīng)等方面討論二者的利弊。從臨床結(jié)局來(lái)看，大樣本量研究提出與ONCAB相比，接受OPCAB手術(shù)的患者其住院死亡率顯著降低，但1～3年的中遠(yuǎn)期結(jié)局無(wú)差異，并且認(rèn)為高齡患者采用OPCAB手術(shù)的早期結(jié)局更好一些。兩項(xiàng)隨機(jī)試驗(yàn)的薈萃分析提示，OPCAB和ONCAB手術(shù)患者在全因死亡率和主要不良心血管事件方面無(wú)顯著差異［8-9］。有研究［10］并未發(fā)現(xiàn)兩組患者的出院結(jié)局存在差異，但OPCAB患者在術(shù)后一年內(nèi)并發(fā)癥發(fā)生率比ONCAB患者更高；死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，且長(zhǎng)期預(yù)后更差［11］。另一項(xiàng)納入2 203名患者的隨機(jī)對(duì)照研究結(jié)果顯示：ONCAB手術(shù)患者5年生存率和無(wú)不良事件生存率均低于OPCAB手術(shù)患者。因此，基于其術(shù)后5年內(nèi)的全因死亡率、主要不良心血管事件發(fā)生率、臨床結(jié)果等指標(biāo)綜合評(píng)估，目前更傾向于建議采用 ONCAB［3，12-13］。

OPCAB手術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于以下幾個(gè)方面：輸血少、房顫率低、腎功能損害輕、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥少以及腦卒中發(fā)生率低等。但OPCAB手術(shù)存在潛在的吻合口問(wèn)題或再血管化不完全導(dǎo)致的圍術(shù)期心肌缺血或心梗，以及為了維持一些心臟特定體位下血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定而導(dǎo)致的液體超負(fù)荷等風(fēng)險(xiǎn)。最近一項(xiàng)研究提出，盡管大多數(shù)OPCAB患者基本實(shí)現(xiàn)了血運(yùn)重建，但與ONCAB相比仍存在較高的不完全血運(yùn)重建率［14］。與之相比，ONCAB的優(yōu)勢(shì)在于術(shù)中能夠維持穩(wěn)定的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，并提高再血管化程度。但血液與CPB管道的接觸也激活了許多級(jí)聯(lián)反應(yīng)［15］，包括激肽釋放酶、血液凝固和補(bǔ)體系統(tǒng)等，從而產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。此外，還有血液稀釋、非搏動(dòng)血流以及缺血再灌注損傷等對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步影響。

從引發(fā)的炎癥反應(yīng)角度來(lái)看，與接受OPCAB的患者相比，ONCAB手術(shù)患者其炎癥反應(yīng)程度較重，表現(xiàn)為：出現(xiàn)明顯的單核細(xì)胞激活，單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6，IL-8和IL-10，出現(xiàn)分泌提前或總量增多；單核細(xì)胞表面表達(dá)CD11b增多并形成單核細(xì)胞-血小板復(fù)合物；血漿IL-8、C3a及C5a水平顯著增加。多數(shù)研究認(rèn)為與ONCAB手術(shù)相比，OPCAB可減少術(shù)后全身反應(yīng)，氧化應(yīng)激和心肌損傷，即術(shù)后會(huì)出現(xiàn)相對(duì)較輕的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。然而，也有研究提示OPCAB和ONCAB手術(shù)患者表現(xiàn)為類(lèi)似的炎癥反應(yīng)，如C反應(yīng)蛋白、IL-6、纖維蛋白原、免疫球蛋白、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，以及T細(xì)胞的植物血凝素反應(yīng)［4］等。以往研究發(fā)現(xiàn)CPB心臟手術(shù)術(shù)后T淋巴細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞（CD4+）減少，而抑制／細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+T）和B細(xì)胞受影響略小。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)與OPCAB相比，接受ONCAB手術(shù)患者并未出現(xiàn)更為明顯的T淋巴細(xì)胞的損傷。也就是說(shuō)，CPB能在滿足術(shù)中維持穩(wěn)定的循環(huán)狀態(tài)及優(yōu)化移植血管血運(yùn)重建率等優(yōu)勢(shì)基礎(chǔ)上，并不會(huì)對(duì)機(jī)體的T淋巴細(xì)胞亞群造成進(jìn)一步的損傷，并為臨床術(shù)式的選擇提供了一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。胸腺輸出、增殖、凋亡，其他免疫細(xì)胞對(duì)其增殖的影響等均參與T淋巴細(xì)胞數(shù)目的調(diào)控，OPCAB和ONCAB引起的T淋巴細(xì)胞數(shù)目降低的機(jī)制是否有所差異，尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

外科手術(shù)創(chuàng)傷亦可誘發(fā)機(jī)體的全身炎癥反應(yīng)，同時(shí)還受到多種內(nèi)外因素的影響，包括麻醉、心包外吸引、CPB環(huán)路，心臟停搏液、出凝血、合并有免疫系統(tǒng)疾病、手術(shù)時(shí)間、其他藥物以及麻醉反應(yīng)等。而CPB對(duì)于大多數(shù)心內(nèi)直視手術(shù)也是必不可少的，筆者認(rèn)為也許探尋更為有效的抵抗炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的方法，可能應(yīng)該更多地關(guān)注于手術(shù)創(chuàng)傷本身而不僅僅是CPB。

本研究為單中心研究報(bào)道，樣本量偏小，具有一定的局限性，但研究結(jié)果足以說(shuō)明兩種手術(shù)策略對(duì)患者圍術(shù)期T淋巴細(xì)胞各亞群及NLR的影響差異較小，為臨床決策提供一些理論依據(jù)及參考。此外，由于本研究?jī)?nèi)容未涉及各細(xì)胞表面主要生物標(biāo)記物的變化，所以相關(guān)免疫細(xì)胞功能的改變需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)探討。

4 結(jié) 論

OPCAB可引起患者外周血中性粒細(xì)胞大量增多，T淋巴細(xì)胞大量減少，與接受OPCAB手術(shù)患者相比，尚未觀察到ONCAB會(huì)進(jìn)一步加劇T淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)目的降低。