GeneXpert MTB/RIF對(duì)涂陰疑似肺結(jié)核及利福平耐藥性檢測(cè)的價(jià)值

周銀發(fā) 李燕平 魏淑貞 林淑芳 趙永 鄭建莉 林建 張山鷹

結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性呼吸道傳染病，2018年WHO[1]估計(jì)全球2017年有1000萬(wàn)例結(jié)核病發(fā)病患者，中國(guó)占9%，位居全球第二；全球估計(jì)新發(fā)耐多藥和利福平耐藥結(jié)核病(multidrug and rifampicin-resistant tuberculosis, MDR/RR-TB)患者55.8萬(wàn)例，中國(guó)占13%，是30個(gè)MDR/RR-TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。因此，早期發(fā)現(xiàn)和治療肺結(jié)核患者對(duì)于控制結(jié)核病傳播具有重要意義。目前，多數(shù)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)主要依靠痰涂片鏡檢來(lái)篩查肺結(jié)核，雖然該方法快速、廉價(jià)，但由于留痰、涂片及鏡檢過(guò)程中受到各種因素的影響，導(dǎo)致分枝桿菌檢出率低，涂片陰性患者較多，易造成誤診漏診，延誤患者診治。痰培養(yǎng)盡管能提高分枝桿菌檢出率，但存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、技術(shù)要求高等缺點(diǎn)[2]。而GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)是基于半巢式實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的全自動(dòng)MTB檢測(cè)系統(tǒng)，整個(gè)流程在2.5 h內(nèi)即可完成，并可同時(shí)檢測(cè)是否對(duì)利福平耐藥。本研究通過(guò)回顧性對(duì)比GeneXpert與傳統(tǒng)痰固體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“痰培養(yǎng)”)及比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“比例法藥敏試驗(yàn)”)對(duì)涂陰疑似肺結(jié)核患者的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)GeneXpert在涂陰疑似肺結(jié)核患者診斷及RR-TB 檢測(cè)中的價(jià)值。

材料和方法

1.資料來(lái)源：查閱2018年龍巖市各縣(區(qū))結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院及市疾病預(yù)防控制中心(簡(jiǎn)稱“CDC”)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果登記本(包括痰涂片鏡檢、MTB痰培養(yǎng)、GeneXpert以及比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果)，并與《結(jié)核病管理信息系統(tǒng)》中患者實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比對(duì)后，排除結(jié)果不一致及肺外結(jié)核患者，共收集659例涂陰疑似肺結(jié)核患者的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，其中307例行GeneXpert檢測(cè)，519例行痰培養(yǎng)及菌種鑒定，228例同時(shí)進(jìn)行Xpert檢測(cè)和痰培養(yǎng)檢測(cè)。最終622例經(jīng)臨床診斷為涂陰肺結(jié)核，納入同時(shí)開展GeneXpert檢測(cè)與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的肺結(jié)核患者101例，排除3例未檢出結(jié)核感染和1例經(jīng)臨床診斷為非結(jié)核與結(jié)核分枝桿菌混合感染，最終納入97例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.涂陰疑似肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]：具有疑似肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)及3次痰涂片鏡檢均陰性的患者。根據(jù)診斷性抗感染、抗結(jié)核治療或進(jìn)一步細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果可分為以下3類：(1)確診為涂陰肺結(jié)核：進(jìn)一步細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果為分枝桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性，或分子生物學(xué)檢查陽(yáng)性，或肺組織病理學(xué)檢查陽(yáng)性的患者；(2)臨床診斷為涂陰肺結(jié)核：無(wú)細(xì)菌學(xué)及肺組織病理學(xué)檢查陽(yáng)性的診斷證據(jù)，但具有肺結(jié)核疑似癥狀或其他輔助檢查(結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、γ干擾素釋放試驗(yàn)及血清結(jié)核抗體檢測(cè)等)陽(yáng)性的診斷證據(jù)，并且經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后有效；(3)其他非肺結(jié)核患者：無(wú)細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)檢查陽(yáng)性結(jié)果，經(jīng)診斷性抗感染或抗結(jié)核藥物治療后排除肺結(jié)核診斷。

3. 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法：(1)痰涂片鏡檢：按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]要求，分別收集每例患者的即時(shí)痰、夜間痰及晨痰各一份進(jìn)行涂片和萋-尼染色顯微鏡檢查，并將剩余的痰標(biāo)本在24 h內(nèi)用于痰培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)。(2)痰培養(yǎng)：依據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[6]要求，采用酸性羅氏固體培養(yǎng)基進(jìn)行MTB分離培養(yǎng)。(3)比例法藥敏試驗(yàn)：按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[7]的要求嚴(yán)格操作。(4)GeneXpert檢測(cè)：采用Cepheid 公司生產(chǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR及試劑對(duì)患者的痰標(biāo)本行MTB及RR-TB檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照系統(tǒng)及試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行。

4.質(zhì)量控制(簡(jiǎn)稱“質(zhì)控”)：(1)實(shí)驗(yàn)室對(duì)每批次染色液均進(jìn)行質(zhì)控；每批次酸性羅氏培養(yǎng)基均進(jìn)行無(wú)菌性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)；龍巖市CDC參加國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏試驗(yàn)熟練度測(cè)試歷年來(lái)均合格通過(guò)；每批次的GeneXpert檢測(cè)試劑盒均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(H37Rv)和陰性對(duì)照(水)。(2)將從實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果登記本數(shù)據(jù)與《結(jié)核病管理信息系統(tǒng)》中的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，排除結(jié)果不一致、涂陽(yáng)以及肺外結(jié)核的患者，確保本研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Excel 2016軟件收集并整理數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同方法對(duì)MTB檢出率(陽(yáng)性率)的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≤0.40時(shí)為一致性差，≥0.75為一致性高度一致，介于二者之間為中度一致。

結(jié) 果

1.以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)GeneXpert 檢測(cè)的效能：以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)MTB的特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與固體培養(yǎng)法一致，均為100.00%；但敏感度(31.40%)高于固體培養(yǎng)法(7.46%)，兩種檢測(cè)方法與臨床診斷結(jié)果一致性均較差。在涂陰疑似肺結(jié)核患者中，GeneXpert對(duì)MTB的檢出率(29.97%，92/307)明顯高于痰培養(yǎng) (7.13%，37/519) (χ2=76.30，P<0.05)。詳見表1。

2.以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)判斷GeneXpert檢測(cè)的效能：以痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢出MTB的敏感度與陰性預(yù)測(cè)值均較高，但特異度與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果呈中度一致。200例痰培養(yǎng)陰性患者中有46例(23.00%)GeneXpert檢出MTB。詳見表2。

3. RR-TB檢測(cè)結(jié)果： 納入同時(shí)開展GeneXpert檢測(cè)與比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的患者101例。在比例法陽(yáng)性患者中，3例GeneXpert未檢出結(jié)核感染(1例經(jīng)菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌感染)。另外1例為GeneXpert檢出利福平敏感，但比例法檢測(cè)結(jié)果為利福平耐藥，且菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)臨床診斷性治療確診該患者為MTB與非結(jié)核分枝桿菌混合感染。余97例(初治87例，復(fù)治10例)患者經(jīng)菌種鑒定及GeneXpert檢測(cè)均確診為感染MTB，其中GeneXpert檢測(cè)出利福平耐藥患者7例，耐藥率為9.28%(7/97)；比例法藥敏檢測(cè)出6例利福平耐藥患者，耐藥率為6.18%(6/97)；兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致率較高(98.97%，96/97)，耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00，P>0.05)。

表1 兩種檢測(cè)方法以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)的診斷效能判斷及比較

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表2 以固體痰培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)Xpert檢測(cè)MTB的效能

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

討 論

肺結(jié)核是由于MTB感染肺部引發(fā)的慢性呼吸道傳染病，細(xì)菌學(xué)檢查是確診肺結(jié)核及RR-TB的重要依據(jù)。其傳染源主要是痰涂片陽(yáng)性(涂陽(yáng))患者，但有研究表明大約17%的肺結(jié)核是由涂陰患者傳播引起[8]，而臨床上無(wú)法從涂陰肺結(jié)核患者痰涂片鏡檢獲得細(xì)菌學(xué)證據(jù)，往往需要其他檢測(cè)手段來(lái)獲得臨床診斷，常因時(shí)間較長(zhǎng)而影響臨床診治；GeneXpert作為一種操作簡(jiǎn)便且檢出時(shí)間短的新型分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，在早期診斷涂陰肺結(jié)核和控制結(jié)核病傳播具有重要意義[9]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)GeneXpert系統(tǒng)進(jìn)行了較多的研究，大多集中在涂陽(yáng)以及痰培養(yǎng)陽(yáng)性(培陽(yáng))結(jié)核病患者，其檢出MTB的敏感度基本可達(dá)97.5%以上，甚至達(dá)100.0%[2,10-13]；而針對(duì)涂陰或痰培養(yǎng)陰性(培陰)結(jié)核病患者M(jìn)TB檢測(cè)的研究較少，且報(bào)道的結(jié)果差別較大，如有文獻(xiàn)顯示，以傳統(tǒng)固體痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，在涂陰疑似肺結(jié)核患者中GeneXpert檢測(cè)MTB的敏感度為55.2%～90.2%[14-15]。而本研究顯示，GeneXpert對(duì)涂陰疑似肺結(jié)核患者檢測(cè)MTB的敏感度為90.32%，略高于文獻(xiàn)報(bào)道的敏感度，但特異度(77.00%)卻低于文獻(xiàn)報(bào)道(93.5%～100.0%)[2,11,15]；提示對(duì)于涂陰疑似肺結(jié)核患者，GeneXpert對(duì)MTB的檢出率明顯高于痰培養(yǎng)。這可能與大多數(shù)涂陰肺結(jié)核患者在進(jìn)行結(jié)核病診斷前均接受過(guò)β內(nèi)酰胺類藥物的治療，而該藥物對(duì)MTB有一定的殺滅作用，導(dǎo)致痰標(biāo)本中MTB荷載量較少或未能及時(shí)培養(yǎng)而導(dǎo)致痰培養(yǎng)陰性[16]有關(guān)。而GeneXpert是基于定量PCR的分子檢測(cè)，能夠從已經(jīng)滅活的MTB中擴(kuò)增出MTB核酸并報(bào)告診斷，可出現(xiàn)痰培養(yǎng)陰性而GeneXpert檢出陽(yáng)性的情況[17]。

另外，本研究中GeneXpert檢測(cè)RR-TB與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果呈高度一致性，兩種方法檢出的利福平耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而GeneXpert檢測(cè)時(shí)間遠(yuǎn)短于比例法藥敏試驗(yàn)，可以及時(shí)為臨床醫(yī)生調(diào)整治療方案提供細(xì)菌學(xué)依據(jù)；但也有研究表明，分子藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)利福平耐藥的穩(wěn)定性和重復(fù)性較比例法藥敏試驗(yàn)好，但如果GeneXpert檢測(cè)應(yīng)用于初治肺結(jié)核患者(非耐藥高危人群)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能，因此如果在非耐藥高危人群中檢出結(jié)果為對(duì)利福平耐藥時(shí)，仍需結(jié)合臨床和表型藥敏試驗(yàn)或其他分子藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果做進(jìn)一步驗(yàn)證[18-19]。本次研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者為非結(jié)核分枝桿菌與MTB混合感染時(shí)，比例法藥敏試驗(yàn)會(huì)受到非結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)菌的影響，僅能檢出對(duì)利福平耐藥的非結(jié)核分枝桿菌；而對(duì)于GeneXpert檢測(cè)，即使在非結(jié)核分枝桿菌濃度很高、MTB濃度很低的混合感染下，仍能檢出MTB[20]，但本研究?jī)H1例此類患者，可能結(jié)論存在偏頗，望今后能進(jìn)一步研究。

綜上所述，GeneXpert是一種操作簡(jiǎn)便、檢出時(shí)間短的分子檢測(cè)技術(shù)，在涂陰疑似肺結(jié)核患者中相對(duì)于固體痰培養(yǎng)具有較高的MTB檢出率，并且對(duì)于RR-TB檢測(cè)的敏感度也較高，可推薦作為基層結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院臨床快速確診涂陰疑似肺結(jié)核及RR-TB的檢測(cè)手段，使結(jié)核病患者得到及早診斷和治療，對(duì)涂陰肺結(jié)核以及利福平耐藥肺結(jié)核的控制具有重大意義。但目前GeneXpert檢測(cè)設(shè)備及配套的試劑盒相對(duì)于固體痰培養(yǎng)與比例法藥敏試驗(yàn)的費(fèi)用均較昂貴，若在基層結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用，則需要政府加大財(cái)政投入或醫(yī)保政策給予支持。