不同方法檢測利福平耐藥結(jié)核病及MTBrpoB基因突變的對比分析

林勇明 黃曉偉 林淑芳 魏淑貞 林建 趙永

耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)是當(dāng)前結(jié)核病控制工作的重點(diǎn)與難點(diǎn)，有效防控MDR-TB是整個結(jié)核病控制工作進(jìn)程的關(guān)鍵控制點(diǎn)。研究表明，大多數(shù)對利福平耐藥的MTB菌株同時也對異煙肼耐藥[1]，MTB對利福平的耐藥情況一定程度上可以反映該地區(qū)的MDR-TB疫情?；蛲蛔兪钱a(chǎn)生耐藥MTB的根本原因，RNA聚合酶β亞基(rpoB基因)突變可引起96%以上的MTB臨床分離株對利福平耐藥[2]，MTB對利福平耐藥的決定區(qū)(rifampin resistance-determining region，RRDR)主要位于507～533區(qū)[3]。目前，MTB耐藥性檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍然是表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)，核酸反向線性探針雜交技術(shù)(屬于GenoType MTBDRplus方法，簡稱“MTBDRplus”)和利福平耐藥實(shí)時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“Xpert技術(shù)”)。但在臨床實(shí)際中，3種方法檢測結(jié)果對部分菌株是否存在利福平耐藥性會出現(xiàn)不同，為了解此類菌株的基因突變情況，筆者對其進(jìn)行了3種方法的耐藥性檢測，并進(jìn)行了ropB基因測序，并將測序結(jié)果與檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析與評價。

資料和方法

一、研究對象

搜集2017年福建省泉州市所轄10個縣(市、區(qū))結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院登記的511例確診肺結(jié)核患者，同時經(jīng)比例法、MTBDRplus與Xpert技術(shù)等3種方法檢測對利福平的耐藥情況，并對3種方法檢測結(jié)果不相同但至少1種結(jié)果為對利福平耐藥的66株 MTB行ropB基因測序，并對55株獲得基因測序結(jié)果的菌株進(jìn)行ropB基因突變情況分析。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

二、研究方法

1.主要儀器和試劑：主要儀器有隔水式恒溫培養(yǎng)箱，GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)(購自美國Cepheid公司)，水浴鍋(購自中國上海精宏公司)，PCR擴(kuò)增儀(購自美國ABI公司),微生物核酸雜交儀(TwinCubator，購自Hain 生命科學(xué)股份有限公司，德國)；主要試劑有羅氏藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基(購自中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、GeneXpert MTB/RIF試劑盒和GenoType MTBDRplusV2試劑盒(均購自美國賽沛公司)。

2.患者入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[4]，痰標(biāo)本分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性并經(jīng)初步菌種鑒別為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的患者確診為肺結(jié)核。(2)對利福平耐藥：根據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]，固體比例法中，耐利福平菌落大于1%則判斷為利福平耐藥；Xpert檢測結(jié)果在檢測系統(tǒng)可直接報(bào)告是否對利福平耐藥；MTBDRplus檢測根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，如果rpoB基因區(qū)至少有1個野生型探針WT缺失或突變型探針Mut染色陽性，則表示試驗(yàn)菌株對利福平耐藥[6]。

3. 痰涂片、痰培養(yǎng)及Xpert檢測：本研究按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]的要求對收集的痰標(biāo)本進(jìn)行萋-尼染色顯微鏡檢查；痰涂片陽性患者由縣級結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)進(jìn)行痰培養(yǎng)，有條件的實(shí)驗(yàn)室同時按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]對痰涂片陽性標(biāo)本進(jìn)行Xpert檢測。

4.藥敏試驗(yàn)：由市疾病預(yù)防控制中心定期收集轄區(qū)內(nèi)各縣級結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室痰涂片陽性的痰標(biāo)本及痰培養(yǎng)管，對所有1279株培陽標(biāo)本采用對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)[6]進(jìn)行初步菌種鑒別，鑒別結(jié)果包括MTB 1169株，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)110株。對鑒定為MTB的臨床分離株應(yīng)用固體比例法進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)，同時采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取711株MTB臨床分離株按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行MTBDRplus 檢測，最終有511株同時進(jìn)行了Xpert檢測、傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和MTBDRplus檢測。

5.細(xì)菌DNA制備：取常規(guī)L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3周、生長良好的MTB一菌環(huán)菌落溶于400 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)緩沖液(pH 8.0)中，在旋渦振蕩器上振蕩至菌落呈塊狀固體，并將其均勻溶于TE緩沖液中，在95 ℃水浴15 min后，離心半徑4 cm，3000 r/min，離心5 min，取上清。

6.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)：從http://www.ncbi.nlm.nih.gov的GenBank 獲得H37Rv的rpoB基因序列。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物F為5′-GAG CCC CCG ACC AAA GA-3′，下游引物R為5′-ATG TTG GGC CCC TCA GG-3′，片段長629 bp[含密碼子507～533的利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance determining region，RRDR)]。反應(yīng)體系共50 μl，包括2×Taq PCR Master Mix 25 μl、上下游引物各1 μl(10 μmol/L)，模板10 μl，去離子水13 μl。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃變性8 min；94 ℃ 30 s，30個循環(huán)；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；再72 ℃延伸5 min。

7. DNA測序和分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證為擴(kuò)增的單一目的條帶后，產(chǎn)物送上海生物工程公司利用基因測序技術(shù)，分別對試驗(yàn)菌株的rpoB基因進(jìn)行序列分析。通過BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 將試驗(yàn)菌株的rpoB基因測序結(jié)果與H37Rv的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對分析，獲得各菌株耐藥基因突變位點(diǎn)及突變特征。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2007錄入結(jié)果數(shù)據(jù)，SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法(當(dāng)理論頻數(shù)<5時)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MTBDRplus與Xpert檢測利福平耐藥情況

511株檢測菌株中，比例法、MTBDRplus、Xpert技術(shù)檢測到利福平的耐藥率分別為38.16%(195/511)、40.51%(207/511)、45.99%(235/511)，MTBDRplus技術(shù)與比例法檢測的利福平耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.590，P=0.442)；而Xpert技術(shù)檢測的利福平耐藥率明顯高于比例法(χ2=6.424，P=0.011)。

以比例法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測利福平耐藥的敏感度(93.85%)與MTBDRplus(95.39%)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.453，P=0.501)；而MTBDRplus的特異度(93.35%)和一致率(94.13%)均明顯高于Xpert技術(shù)[分別為83.54%和87.48%](χ2=14.88、13.54，P值均=0.000)。詳見表1。

二、ropB基因突變情況

檢測的511株菌株中，3種方法檢測結(jié)果不完全相同的菌株有66株，其中55株獲得rpoB基因序列，7株凍存的菌株未能成功傳代致DNA提取失敗，4株未能獲得測序結(jié)果。

1. 測序菌株的ropB基因突變情況：獲得rpoB基因序列的55株菌株中，47株(85.46%)ropB基因在371～566位點(diǎn)間的17個位置發(fā)生了36種類型的突變，其中372、373、374、376、377、378、379、382、516和526等10個氨基酸位點(diǎn)均分別發(fā)生了2種或2種以上類型的突變，尤以377位明顯[42株(76.36%)發(fā)生了6種類型的突變]，其次為511位[7株(12.73%)發(fā)生了1種類型的突變]。其中13株(23.64%)發(fā)生堿基缺失或插入(均在377位)；7株(12.73%)發(fā)生點(diǎn)突變，有5株(71.43%)發(fā)生在RRDR區(qū)外；27株(49.09%)發(fā)生聯(lián)合突變，有11株(40.74%)發(fā)生在RRDR區(qū)外。另外，40株(72.73%)菌株內(nèi)還發(fā)現(xiàn)50個無意義突變(即不影響編碼蛋白的表達(dá)，結(jié)構(gòu)或功能無明顯變化)。詳見表2。

表1 以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，不同方法檢測MTB臨床分離株利福平耐藥性的檢測效能

注敏感度=真耐藥株數(shù)/(真耐藥株數(shù)+假敏感株數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真耐藥株數(shù)/(真耐藥株數(shù)+假耐藥株數(shù))×100%，特異度=真敏感株數(shù)/(假耐藥株數(shù)+真敏感株數(shù))×100%，陰性預(yù)測值=真敏感株數(shù)/(假敏感株數(shù)+真敏感株數(shù))×100%，一致性=(真耐藥株數(shù)+真敏感株數(shù))/總株數(shù)×100%

表2 55株獲得基因序列的MTB菌株rpoB基因突變分布情況

續(xù)表2

注“-”代表 “缺失

表3 3種方法檢測利福平耐藥結(jié)果異同的MTB臨床分離株rpoB基因突變情況

注突變率=(點(diǎn)突變菌株數(shù)+聯(lián)合突變菌株數(shù)+缺失或插入菌株數(shù))/獲得基因序列菌株數(shù)×100%

2. 利福平耐藥結(jié)果異同菌株的ropB基因突變情況：55株獲得rpoB基因序列中，45株為比例法檢測利福平敏感而分子藥敏試驗(yàn)(1種或2種方法)檢測為耐藥，其中40株(88.89%，40/45)rpoB基因發(fā)生有意義突變，包括15株(37.50%，15/40)發(fā)生在RRDR區(qū)(2株為RRDR區(qū)點(diǎn)突變，13株為聯(lián)合RRDR區(qū)位點(diǎn)突變)；8株為比例法檢測利福平耐藥而MTBDRplus與Xpert檢測均敏感，其中6株rpoB基因發(fā)生有意義突變(即影響編碼蛋白的表達(dá)，結(jié)構(gòu)或功能有明顯變化；包括2株為聯(lián)合RRDR區(qū)位點(diǎn)的突變)。比例法與分子藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥結(jié)果不一致的兩類菌株之間突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher確切概率法，P=0.121)。詳見表3。

3. MTBDRplus與Xpert檢測結(jié)果異同菌株的ropB基因突變情況：測序的55株菌株中，MTBDRplus與Xpert檢測利福平耐藥結(jié)果相同的菌株有22株，兩者均耐藥的14株菌株均發(fā)生ropB基因突變，其中10株(71.43%，10/14)在RRDR區(qū)位點(diǎn)發(fā)生突變；而兩者均敏感的8株菌株中，有6株菌株ropB基因發(fā)生突變，其中只有1株在RRDR區(qū)位點(diǎn)發(fā)生突變。MTBDRplus與Xpert檢測利福平耐藥結(jié)果不同的菌株有33株，其中31株為MTBDRplus檢測敏感而Xpert檢測為耐藥，有26株(83.87%)在ropB基因的371～566位點(diǎn)間的13個位置發(fā)生了25種類型的突變，但只有1株(3.85%，1/26)在RRDR區(qū)位點(diǎn)發(fā)生突變；2株為MTBDRplus檢測耐藥而Xpert檢測為敏感，其中1株在ropB基因的373、377和516的位置發(fā)生了3種類型的聯(lián)合突變。

討 論

控制耐多藥結(jié)核病，除了有效的治療管理外，通過快速診斷耐藥結(jié)核病患者，做到早期發(fā)現(xiàn)、早期合理治療，對預(yù)防MDR-TB的發(fā)生和傳播至關(guān)重要。目前我國耐藥結(jié)核病的診斷仍然主要依靠傳統(tǒng)的涂片、培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)?？顾釛U菌痰涂片鏡檢方法操作簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、特異度強(qiáng)，因此在基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最為廣泛，但敏感度較低；固體培養(yǎng)以改良羅氏培養(yǎng)基為主，敏感度較涂片鏡檢高，價格較低廉，但陽性培養(yǎng)結(jié)果一般需要1個月左右才能報(bào)告，陰性結(jié)果則需要等待2個月方可報(bào)告；采用固體比例法藥敏試驗(yàn)和液體藥敏試驗(yàn)分別需要1個月和2 周左右才能報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果，故傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床診治的需要；而目前只有分子檢測能夠快速發(fā)現(xiàn)耐藥MTB，因此建立快速且可靠的藥敏試驗(yàn)方法是目前結(jié)核病基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。

基于以上原因，WHO[7]于2015年推薦使用線性探針檢測(line probe assay，LPA)和Xpert兩種技術(shù)。本研究顯示，MTBDRplus和Xpert技術(shù)用于MTB臨床分離株檢測對利福平耐藥的敏感度分別達(dá)到95.39%和93.85%，和國內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道相似[6,8]，提示分子藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥性具有較高的敏感度，其及時發(fā)現(xiàn)和快速診斷MDR-TB方面的作用已得到廣大結(jié)核病防治人員的接受與認(rèn)可[7-8]。然而由于不同檢測方法間敏感度與特異度的差異，會出現(xiàn)不同方法檢測同一菌株時對利福平是否耐藥的結(jié)果不相同，使臨床診斷造成困惑。

表型藥敏試驗(yàn)檢測利福平為敏感而分子藥敏試驗(yàn)檢測為耐藥(至少1種或2種方法檢測均耐藥)的菌株，經(jīng)基因測序復(fù)核，88.89%的菌株在ropB基因發(fā)生有意義的突變，突變位點(diǎn)廣泛，以聯(lián)合突變?yōu)橹?，?/3的突變發(fā)生在RRDR區(qū)外，而表型藥敏試驗(yàn)檢測對利福平耐藥、分子藥敏試驗(yàn)檢測對利福平敏感的8株菌株中有75.00%的菌株有rpoB基因發(fā)生有意義突變，但也有2株菌株未發(fā)生突變，與國內(nèi)其他研究差別較大[10-14]。對于二者檢測產(chǎn)生不同結(jié)果的可能原因如下：(1)可能臨床患者中存在異質(zhì)性耐藥菌株[15]；(2)推測ropB基因RRDR區(qū)外還存在影響MTB對利福平耐藥的其他未知機(jī)制[16]；(3)非ropB基因突變引起耐藥，等等。

研究結(jié)果還顯示，MTBDRplus技術(shù)的特異度和一致率均高于Xpert 技術(shù)，若未進(jìn)行基因復(fù)核，僅以表型藥敏試驗(yàn)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，Xpert技術(shù)檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)更多的“假陽性”結(jié)果。通過對66株菌株ropB基因測序發(fā)現(xiàn)，MTBDRplus與Xpert技術(shù)檢測利福平均耐藥的14株菌株ropB基因的突變位點(diǎn)10株(71.43%)發(fā)生在RRDR區(qū)內(nèi)；而兩者結(jié)果均敏感的8株菌株和不一致的33株菌株，分別有5株和25株發(fā)生的ropB基因突變位點(diǎn)都在RRDR區(qū)外，提示臨床實(shí)踐中，經(jīng)分子藥敏試驗(yàn)檢測耐藥而表型藥敏試驗(yàn)檢測為敏感的菌株，不能輕易判斷分子檢測結(jié)果為“假陽性”。

本研究僅對3種方法檢測結(jié)果不相同且至少1種結(jié)果為利福平耐藥的66株菌株進(jìn)行了ropB基因測序，僅55株獲得了基因測序結(jié)果，不能以基因測序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)判斷不同方法檢測MTB臨床分離株對利福平耐藥的效能，僅揭示部分菌株存在的基因突變，無法進(jìn)一步深入分析其耐藥與突變的機(jī)制。

綜上所述，MTB對利福平是否耐藥的結(jié)果判斷時應(yīng)遵循《結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測專家共識》[15]原則，只要任何一種方法檢測為利福平耐藥，首先應(yīng)考慮該株MTB對利福平耐藥；應(yīng)盡快采用其他檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，同時結(jié)合異煙肼耐藥性的篩查，以便及早發(fā)現(xiàn)、診斷MDR-TB患者。