胃癌組織幽門螺桿菌vacA基因型的分布及其與CDX2表達的關系

梁莉 薄威 張忠

[摘要] 目的 篩查遼寧地區(qū)胃癌患者幽門螺桿菌（Helicobacte pylori，H.pylori）vacA優(yōu)勢基因型并了解其對CDX2表達的影響，為胃癌的發(fā)生機制及因型施治提供實驗室依據(jù)。 方法 采用GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT試劑盒提取173例H.pylori陽性石蠟包埋胃癌組織的DNA;采用PCR檢測H.pylori不同vacA基因型分布情況，采用免疫組化方法檢測胃癌組織CDX2蛋白表達。 結果 在胃癌中vacAs1，vacAm1，vacAs1m1亞型分布高于其他亞型（P<0.05），其中vacAm1，vacAs1m1與腫瘤分化程度密切相關，二者在高分化組的分布低于中低分化組（P<0.05），vacAm1在男性患者中分布高于女性（P<0.05）;年齡大于60歲、高分化和腸型胃癌與CDX2的表達呈正相關（P<0.01）;CDX2的低表達與vacAm1，vacAs1，vacAs1m1基因型密切相關（P<0.05）。 結論 vacAm1，vacAs1與vacAs1m1是遼寧地區(qū)胃癌發(fā)生的優(yōu)勢基因型，vacAs1m1陽性的H.pylori患者及男性vacAm1 H.pylori陽性感染者可能抑制CDX2的表達進而促進胃癌的惡性分化。

[關鍵詞] 胃癌;幽門螺桿菌;空泡毒素基因;尾型同源框轉錄因子2

[中圖分類號] R735.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）13-0005-05

[Abstract] Objective To screen the dominant vacA genotypes of Helicobacte pylori（H.pylori） in gastric cancer patients in Liaoning and to understand its effect on CDX2 expression， in order to provide laboratory evidence for the mechanism and treatment of gastric cancer. Methods 173 pure H.pylori-positive paraffin-embedded gastric cancer tissues were extracted with GT pureTM FFPE tissue DNA Extraction KIT kit. PCR was used to detect the distribution of different vacA genotypes of H.pylori， and the expression of CDX2 protein in gastric cancer tissues was detected by immunohistochemistry. Results The distribution of vacAs1， vacAm1 and vacAs1m1 subtypes in gastric cancer was higher than that of other subtypes（P<0.05）. Among them， vacAm1 and vacAs1m1 were closely related to the degree of tumor differentiation， and the distribution of the two in the highly differentiated group was lower than that in the moderately and poorly differentiated group（P<0.05）. vacAm1 was higher in male patients than in females（P<0.05）. Age greater than 60 years， high-differentiation and intestinal type gastric cancer were positively correlated with CDX2 expression（P<0.01）. Low expression of CDX2 was closely related to vacAm1， vacAs1 and vacAs1m1 genotypes（P<0.05）. Conclusion vacAm1， vacAs1 and vacAs1m1 are the dominant genotypes of gastric cancer in Liaoning. The vacAs1m1-positive H.pylori patients and male vacAm1 H.pylori positive infectors may inhibit the expression of CDX2 and promote the malignant differentiation of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer;Helicobacter pylori;Vacuolating toxin gene;Cadual-related homeobox transcription factor 2（CDX2）

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)最新統(tǒng)計顯示其死亡率仍處于世界腫瘤排名第三位[1]。據(jù)流行病學顯示幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染與胃癌的發(fā)生密切相關[2]，其釋放的多種毒力因子為主要致病因素，目前研究較為廣泛的是空泡毒素基因（vaculating toxin gene A，vacA），其基因序列上存在信號區(qū)（s1，s2）和中間區(qū)（m1，m2），可將H.pylori分為s1m1、s1m2、s2m1和s2m2四種基因亞型，這些基因亞型的分布可因地域的不同而不同，且與胃癌的關系不同[3，4]。目前其基因型在遼寧地區(qū)胃癌患者的分布尚不清楚，該基因型如何導致胃癌的發(fā)生尚需研究。

尾型同源框轉錄因子2（cadual-related homeobox transcription factors 2，CDX2）是同源框基因家族中的一員，作為一種腸上皮特異性標志物，在正常的腸上皮細胞中表達，而在正常胃上皮細胞中不表達，有研究表明CDX2表達對胃癌尤其是腸型胃癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用。在研究CDX2與胃癌發(fā)生相關性時，人們發(fā)現(xiàn)H.pylori的另一毒力因子CagA[5，6]感染可影響CDX2表達情況進而促使胃癌的發(fā)生發(fā)展。但cagA基因僅存在于部分H.pylori中，而vacA基因存在于所有的H.pylori，關于vacA基因亞型對CDX2表達的影響尚不清楚。因此，本研究將通過檢測不同亞型的H.pylori vacA基因在遼寧地區(qū)胃癌患者中的分布及其對CDX2的表達影響，篩選遼寧地區(qū)胃癌患者H.pylori vacA的優(yōu)勢基因型及其與CDX2表達之間的關系，從而為胃癌的發(fā)生機制及因型施治提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本資料

本研究選取2010年1月～2014年12月沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院外科手術切除的H.pylori陽性的胃癌石蠟包埋組織樣本173例，其中男137例，女36例，年齡24～87歲，中位年齡60歲，本研究所得樣本已通過沈陽醫(yī)學院倫理委員會批準。

1.2 試劑盒提取石蠟組織DNA

石蠟組織中DNA提取采用GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT試劑盒（北京天根生化科技），石蠟組織標本連續(xù)切片10～12片，厚度5 μm/片，置于1.5 mL離心管中，按照試劑盒說明書操作。提取的DNA樣本，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR檢測H.pylori vacA不同基因亞型

H.pylori vacAs1，vacAs2，vacAm1，vacAm2特異引物（上海生工合成），分別進行巢式PCR擴增，相關特異性引物序列見文獻[7]。反應體系均為25 μL，包括模板DNA 2 μL，2×Taq Master Mix（江蘇溥博公司）12.5 μL，引物1.25 μL，蒸餾水補足至25 μL。巢式PCR反應條件：①vacAs1反應條件：95℃ 5 min，（95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min）40 cycle，72℃ 1 min，4℃;其余基因亞型反應條件：第一次擴增條件為95℃ 5 min，（95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min）35 cycle，72℃ 1 min，4℃;第二次擴增條件為95℃ 5 min，（95℃ 1 min，54℃1 min，72℃ 1 min）30 cycle，72℃ 1 min，4℃。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像分析結果。

1.4 免疫組化（ElivisionTM plus法）

采用ElivisionTM plus法檢測CDX2蛋白表達，鼠抗人CDX2單抗購買自北京中杉金橋，相關試劑盒購買自福州邁新公司。CDX2一抗以1：100比例稀釋滴加，4℃過夜，以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性組織作為陽性對照，步驟參照試劑盒說明書。

1.5 免疫組化評分標準

免疫組化染色為胞核陽性，主要評價杯狀細胞與柱狀細胞的染色情況。評分標準：根據(jù)染色程度，無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;根據(jù)染色細胞數(shù)，<10%為0分，10%～30%為1分，30%～50%為2分，>50%為3分;將染色程度與陽性細胞數(shù)評分相加，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。將陰性與弱陽性評為陰性，中陽性與強陽性評為陽性。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗與Logistics回歸分析H.pylori vacA基因型與胃癌分化程度、CDX2表達之間相關性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理資料

本研究選取173例沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院外科手術切除的H.pylori陽性胃癌患者組織，相關臨床病理資料如下表所示，因本組病例年齡呈偏態(tài)分布，所以取中位年齡60歲為界，年齡>60歲95例，年齡≤60歲78例;其余分組均根據(jù)文獻[8，9];男性胃癌患者137例，是女性患者的3.8倍;腫瘤直徑<5 cm 86例，直徑≥5 cm 87例;按照腫瘤分化程度，中分化（67/173，38.73%）與低分化（81/173，46.82%）胃癌患者高于高分化組（25/173，14.45%）胃癌患者;有淋巴結轉移患者128例，占73.99%;按照Lauren分型，腸型胃癌93例，占53.76%，彌漫型胃癌80例，占46.24%。見表1。

2.2 不同H.pylori vacA基因亞型在胃癌中的分布

經PCR凝膠成像顯示有亮帶出現(xiàn)即為H.pylori vacA基因陽性，反之為陰性，其中vacAs1片段長度為141bp;vacAs2片段長度為153bp;vacAm1片段長度為102bp;vacAm2片段長度為181bp。

單獨分析各亞型分布結果顯示，vacAs1亞型（109/173，63.01%）在胃癌中的分布高于vacAs組其他亞型，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;vacAm1亞型（63/173， 36.99%）在胃癌中的分布高于vacAm組其他亞型，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;合并分析vacAs亞型與vacAm亞型，vacAs1m1亞型（44/173，25.43%）在胃癌中表達率均高于其他亞型，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 H.pylori vacA優(yōu)勢基因型與胃癌患者不同分化程度的關系

比較H.pylori vacA不同基因亞型及臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，H.pylori vacA不同基因亞型僅與分化程度和性別有關。其中，vacAm1和vacAs1m1基因型與分化程度密切相關（P<0.05），進一步分層分析顯示在中低分化組的分布明顯高于高分化組（表3），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。vacAm1與性別密切相關，且男性（56/64，87.5%）高于女性（8/64，12.5%），具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），其他組無顯著統(tǒng)計學差異。

2.4 CDX2表達與胃癌患者臨床病理特性的關系

結果顯示，CDX2的表達與性別、腫瘤直徑、大體分型、浸潤深度及淋巴結轉移均無關，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;但其表達與年齡、腫瘤分化程度、Lauren分型密切相關，其中年齡>60歲患者CDX2表達明顯高于≤60歲者，差異有高度統(tǒng)計學意義[經年齡性別調整后OR=2.738，95%CI=（1.304～5.737），P<0.01];同樣在高分化組中CDX2的表達明顯高于中分化與低分化組，差異有高度統(tǒng)計學意義[經年齡性別調整后OR=15.114，95%CI=（3.338～68.432），P<0.01];CDX2的表達在腸型胃癌組明顯高于彌漫性胃癌組，具有高度統(tǒng)計學差異[經年齡性別調整后OR=3.143，95%CI=（1.682～5.872），P<0.01]。見表4。

2.4 H.pylori vacA優(yōu)勢基因型與CDX2表達的關系

進一步分析H.pylori vacA優(yōu)勢基因型與CDX2表達之間的關系，結果顯示，CDX2表達與H.pylori vacAs1，vacAm1，vacAs1m1亞型密切相關，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且當此三種基因型為陽性時，CDX2陽性表達率均明顯降低。見表5。其余vacA基因亞型與CDX2表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05），未在表中列出。

3 討論

胃癌作為全球高發(fā)病率高死亡率的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與H.pylori感染密切相關。大量國內外研究顯示，在胃病患者的胃黏膜中可檢測出H.pylori，僅有少數(shù)H.pylori感染者會出現(xiàn)胃癌等嚴重的臨床結局[9]，究竟何種H.pylori感染可引起胃癌的發(fā)生，其作用機制已成為亟待研究的重點。目前研究表明，H.pylori不同分離株間存在巨大的遺傳差異，這些遺傳學的差異影響著H.pylori毒力因子的功能、抗原性[10-12]及致病性，導致不同基因型組合與疾病的關系不同。有關H.pylori毒力因子的研究中，vacA基因與胃癌的關系成為關注焦點，由于其基因序列上存在多態(tài)性位點，決定了攜帶不同vacA等位基因亞型的H.pylori菌株毒力及致病性不同。目前研究認為[3，13]，vacAs1m1基因型的H.pylori菌株可產生更高水平的毒素，是H.pylori致病性的標志，與胃癌的發(fā)生密切相關，但存在著地域差別。另有研究表明，vacAs1m2基因型菌株也可釋放大量毒素，且與胃癌癌前病變的發(fā)生密切相關[14]，但尚未有相關胃癌的研究;vacAs2m2亞型編碼的蛋白無活性。因此本研究通過單獨/聯(lián)合檢測遼寧地區(qū)胃癌組織不同vacA基因亞型的分布發(fā)現(xiàn)，vacAs1、vacAm1與vacAs1m1基因亞型在胃癌中的分布高于其他亞型，提示在遼寧地區(qū)這些基因型與胃癌發(fā)生密切相關，是胃癌發(fā)生的優(yōu)勢基因型，與大部分的文獻報道[15，16]結果一致，不同點在于文獻中大多采用是菌培養(yǎng)的方法進行分析，而本次研究所用DNA樣本均來自石蠟包埋組織，可以更好地體現(xiàn)H.pylori在人體中的生長情況，為分析胃癌中vacA基因亞型的分布提供了便利。

在此基礎上進一步分析vacA基因型與胃癌臨床特性的關系，結果顯示vacAm1和vacAs1m1基因型在高分化組分布低于中、低分化組，其他基因型與胃癌的分化無關，提示vacAm1和vacAs1m1基因型與胃癌發(fā)生中、低分化密切相關。同時還發(fā)現(xiàn)vacAm1在男性胃癌患者中的分布顯著高于女性，提示該基因型可能是導致男性患者發(fā)生胃癌的毒力因子，具體原因尚需進一步研究。

為進一步探討這些優(yōu)勢基因型與胃癌發(fā)生的關系，本研究選取與胃癌發(fā)生密切相關的轉錄因子CDX2進行研究。本研究結果顯示，CDX2表達與60歲以上、腸型胃癌和高分化胃癌密切相關，而與性別、浸潤深度、腫瘤直徑和淋巴結轉移無關。提示CDX2作為一個反映細胞分化成熟的指標在胃癌，特別是高分化腸型胃癌中發(fā)揮重要的指示作用。CDX2的表達提示胃癌分化成熟，具有腸表型特征。大量國內外研究顯示CDX2在胃癌組織中呈高表達[17-19]。無論胃癌發(fā)展到何階段，具有腸表型的胃癌（CDX2蛋白表達和相對mRNA水平）均明顯高于具有胃表型的胃癌，并且研究顯示CDX2陽性表達的胃癌分化程度好，淋巴結轉移少，存活時間長，預后較好[20]。

在此基礎上，進一步分析vacA不同基因型對CDX2表達的影響，結果顯示僅vacAs1、vacAm1與vacAs1m1三個優(yōu)勢基因型與CDX2的表達呈負相關，結合vacAm1和vacAs1m1基因型與胃癌臨床關系的研究，提示vacA具有較強毒力的基因型可抑制CDX2表達，從而導致胃黏膜組織出現(xiàn)中、低分化。關于這方面的直接作用機制研究尚未見報道，需要進一步研究。但是有研究顯示CDX2過度表達可抑制IL-6/STAT3通路，進而抑制cyclin-D1、survivin、Bcl-2表達，促進Bax表達，抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖[21];外源性CDX2作用于CDX2缺陷的胃癌細胞后，細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學改變和嚴重的生長抑制[22]，進一步表明CDX2在胃癌細胞中可抑制腫瘤的惡性生長。此外，已有研究證明H.pylori感染對CDX2的表達具有一定影響。目前有大量體內外研究證實H.pylori感染可通過多種作用機制誘導CDX2的表達，Asano N等[2]研究顯示在AGS細胞中，H.pylori感染后誘導的Cdx2表達依賴于NF-κB，進而促進胃癌癌前病變的發(fā)生;另外體外的實驗研究[23]顯示H.pylori特別是CagA陽性（含有致病島）的菌株能引起胃癌細胞系（AGS、NUGC-4、KATOIII）CDX2蛋白水平和mRNA水平增高，Camilo V等[24]選用兩種H.pylori菌株（26695有致病島，TX30無致病島）共同感染AGS細胞，24 h后加入BMP2，結果顯示在266695菌株中BMP2及下游蛋白SMAD4和p-SMAD1/5/8增高，同時CDX2水平均增高，動物實驗進一步證實H.pylori可通過BMP途徑上調CDX2，下調SOX2，進而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，但是多局限于cagA基因亞型上。

綜上，本研究認為vacAs1、vacAm1與vacAs1m1為遼寧地區(qū)胃癌發(fā)生的優(yōu)勢基因型，攜帶此三種基因型尤其是60歲以上，vacA s1m1陽性的H.pylori患者及男性vacAm1 H.pylori感染可能抑制CDX2的表達進而促進胃癌的惡性分化，對于這部分人群相關作用機制尚需進一步深入研究。

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（收稿日期：2018-12-25）