IGF- 1 R、EGFR和p53在胸腺上皮瘤中的表達(dá)及臨床意義

王蘭朋，武麗蕊，王超

廊坊市人民醫(yī)院1胸外科3實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊065000

2河北中石油中心醫(yī)院婦科，河北 廊坊0650000

胸腺上皮瘤是臨床中常見的縱隔腫瘤，在縱隔腫瘤中所占的比例為15%～20%，其主要病理表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在非腫瘤細(xì)胞的浸潤。胸腺上皮瘤患者多存在免疫系統(tǒng)失衡的現(xiàn)象，因此會(huì)引發(fā)重癥肌無力等多種免疫性疾病，對患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的影響[1-2]。目前臨床上對于胸腺上皮瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有研究顯示，胸腺上皮瘤的發(fā)生與相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)異常密切相關(guān)[3]。胰島素樣生長因子-1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）是酪氨酸蛋白激酶家族的成員，是一種糖蛋白跨膜受體，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系[4]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種跨膜糖蛋白受體，能夠促進(jìn)腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[5]。p53基因是一種抑癌基因，是細(xì)胞生長、增殖的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后及生物學(xué)特性具有相關(guān)性，對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的調(diào)控起關(guān)鍵作用[6]。目前，關(guān)于IGF-1R、EGFR、p53蛋白表達(dá)與胸腺上皮瘤關(guān)系的相關(guān)報(bào)道較少，因此，本研究對IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中的表達(dá)情況及臨床意義進(jìn)行了探討，旨在為臨床醫(yī)師診治胸腺上皮瘤提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年3月至2015年2月廊坊市人民醫(yī)院收治的胸腺上皮瘤患者的胸腺上皮瘤組織存檔石蠟標(biāo)本。胸腺上皮瘤患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過病理組織學(xué)檢查確診為胸腺上皮瘤；②未接受過放化療治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并先天性免疫系統(tǒng)疾??；③哺乳期或妊娠期婦女。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入82例胸腺上皮瘤患者的胸腺上皮瘤組織標(biāo)本。82例胸腺上皮瘤患者中，男45例，女37例；年齡為41～76歲，平均年齡為（62.14±3.27）歲；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，合并重癥肌無力43例；Masaoka分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期48例。另選取同期胸腺濾泡性增生患者的胸腺濾泡性增生組織存檔石蠟標(biāo)本為對照，納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為胸腺濾泡性增生；②臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤患者；②哺乳期或妊娠期婦女；③合并先天性免疫系統(tǒng)疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入60例胸腺濾泡性增生患者，其中，男32例，女28例；年齡為31～74歲，平均年齡為（59.87±3.81）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

電子顯微鏡購于深圳超眼科技有限公司，鼠抗人IGF-1R單克隆抗體購于美國NeoMarkers公司，鼠抗人EGFR單克隆抗體購于美國Sigma公司，鼠抗人p53單克隆抗體購于丹麥Dako公司；IGF-1R、EGFR、p53檢測試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。免疫組織化學(xué)染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購于徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測胸腺上皮瘤組織和胸腺濾泡性增生組織中IGF-1R、EGFR、p53蛋白的表達(dá)情況。具體方法：取石蠟包埋組織進(jìn)行切片，切片厚度為4 μm。采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法進(jìn)行染色：將組織切片置于65℃下烘烤12 h，然后脫蠟、水化切片，應(yīng)用3%的過氧化氫對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行滅活，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗標(biāo)本2次，依次加入鼠抗人IGF-1R單克隆抗體、鼠抗人EGFR單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體，再應(yīng)用PBS沖洗標(biāo)本2次，然后加入鏈霉素工作液（經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記），置于溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育25 min，完成后應(yīng)用PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木素復(fù)染，應(yīng)用中性樹膠進(jìn)行封固。

1.4 染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

染色結(jié)果由兩名高資歷病理科醫(yī)師進(jìn)行觀察，以胸腺上皮瘤組織和胸腺濾泡性增生組織中上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜呈棕褐色或黃色顆粒判定為IGF-1R陽性染色，以上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜呈棕褐色或黃色顆粒判定為EGFR陽性染色，以腫瘤上皮細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色、棕黃色或黃色顆粒判定為p53陽性染色。每個(gè)切片選擇10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察，于每個(gè)視野下觀察100個(gè)細(xì)胞的著色情況。①染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淡黃色計(jì)1分，基本無著色計(jì)0分。陽性細(xì)胞所占百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞所占百分比≤5%計(jì)0分，陽性細(xì)胞所占百分比為6%～25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞所占百分比為26%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占百分比≥51%計(jì)3分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比的乘積為0～2分判定為IGF-1R、EGFR、p53陰性表達(dá)，染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比的乘積為3～9分判定為IGF-1R、EGFR、p53陽性表達(dá)。

1.5 觀察指標(biāo)及隨訪

比較胸腺上皮瘤組織和胸腺濾泡性增生組織中IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)情況，并分析IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中的陽性表達(dá)情況與胸腺上皮瘤患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。以電話隨訪的方式對全部患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2016年3月，統(tǒng)計(jì)胸腺上皮瘤患者的生存與死亡例數(shù)，并對生存與死亡的胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)情況進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白在胸腺上皮瘤組織和胸腺濾泡性增生組織中陽性表達(dá)情況的比較

IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中的陽性表達(dá)率均明顯高于胸腺濾泡性增生組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 胸腺上皮瘤組織與胸腺濾泡性增生組織中IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白陽性表達(dá)情況與胸腺上皮瘤患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡、世界衛(wèi)生組織（WHO）分型、腫瘤直徑胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Masaoka分期為Ⅲ～Ⅳ期胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中的IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)率均高于Masaoka分期為Ⅰ～Ⅱ期的胸腺上皮瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.251、6.037、7.212，P＜0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中的IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胸腺上皮瘤患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.070、5.398、16.943，P＜0.05）。（表2）

2.3 IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白陽性表達(dá)情況與胸腺上皮瘤患者預(yù)后的關(guān)系

截至2016年3月，共失訪6例，獲得隨訪76例，其中，43例胸腺上皮瘤患者生存。將76例胸腺上皮瘤患者分為生存組與死亡組，死亡組胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于生存組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表2 不同臨床特征胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白的陽性表達(dá)情況（ n=82）

表3 兩組胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白的陽性表達(dá)情況[ n（%）]

2.4 IGF- 1 R、EGFR、 p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，EGFR與IGF-1R的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.270，P=0.032），EGFR與p53的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.443，P=0.014），IGF-1R與p53的陽性表達(dá)無相關(guān)性（r=-0.121，P=0.918）。

3 討論

胸腺上皮瘤可發(fā)生于各年齡段的人群，中年人為該腫瘤的高發(fā)人群。在發(fā)病早期，胸腺上皮瘤患者的腫瘤體積較小，無明顯的臨床癥狀，臨床檢查的漏診率較高；當(dāng)腫瘤體積增大至一定程度時(shí)，周圍組織器官會(huì)受到壓迫，進(jìn)而患者會(huì)表現(xiàn)出胸悶、胸痛、發(fā)熱、咳嗽、體重減輕等癥狀，一旦確診患者已經(jīng)發(fā)展至中晚期，臨床治療效果及預(yù)后均較差。因此，尋找能夠輔助診斷惡性腫瘤及評估腫瘤惡性程度及預(yù)后的分子標(biāo)志物成為臨床研究的熱點(diǎn)[7-9]。

IGF-1R廣泛存在于人細(xì)胞質(zhì)區(qū)、胞外區(qū)及跨膜區(qū)，是一種糖蛋白跨膜受體。據(jù)相關(guān)研究結(jié)果顯示，IGF-1R在乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中均異常表達(dá)，且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)[10-11]。EGFR是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，是由原癌基因c-erbB-1編碼，在多種惡性腫瘤中的表達(dá)水平均較高，且被認(rèn)為是對惡性腫瘤患者生存情況影響最大的分子標(biāo)志物。有研究指出，EGFR的過表達(dá)與惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、活動(dòng)性、浸潤性、細(xì)胞凋亡抑制、黏連性及新生血管的形成均具有密切的關(guān)系[12-14]。p53基因是機(jī)體內(nèi)重要的抑癌基因，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要因子，在正常細(xì)胞中能夠有效地抑制腫瘤的增殖，并對細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生，但突變的p53基因則可參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中的陽性表達(dá)率均明顯高于胸腺濾泡性增生組織（P＜0.01），Masaoka分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中的IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)率均高于Masaoka分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且死亡組胸腺上皮瘤患者胸腺上皮瘤組織中IGF-1R、EGFR、p53蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于生存組（P＜0.01），說明IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中的表達(dá)水平較高，且可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R、EGFR、p53蛋白陽性表達(dá)率高的胸腺上皮瘤患者，其生存率較低。分析其原因主要包括以下3個(gè)方面：①IGF-1R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠使細(xì)胞的黏附性發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞向惡性方向發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生；②EGFR異常表達(dá)會(huì)對細(xì)胞核的正常轉(zhuǎn)錄造成干擾，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而對腫瘤的發(fā)展發(fā)揮促進(jìn)作用；③p53基因在突變后可發(fā)揮致癌基因的作用，其高表達(dá)可有效促進(jìn)胸腺上皮瘤的發(fā)生以及浸潤和轉(zhuǎn)移。宋楠等[15]研究發(fā)現(xiàn)，p53與胸腺上皮瘤的分型具有一定的關(guān)系，其陽性表達(dá)率隨著腫瘤細(xì)胞異型程度的增加而升高。然而，本研究結(jié)果顯示，p53陽性表達(dá)可能與WHO分型無關(guān)，分析其原因可能與樣本的選擇和樣本數(shù)量的不同有關(guān)。通過對IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，EGFR與IGF-1R、p53蛋白的陽性表達(dá)均呈正相關(guān)，IGF-1R與p53的陽性表達(dá)無相關(guān)性，說明EGFR、IGF-1R、p53蛋白共同參與了胸腺上皮瘤的發(fā)生與發(fā)展。EGFR與IGF-1R的陽性表達(dá)呈正相關(guān)的機(jī)制可能是因?yàn)镮GF-1R的異常表達(dá)能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的合成與釋放，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，進(jìn)而使EGFR的表達(dá)水平也隨之升高，共同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展；EGFR與p53的陽性表達(dá)呈正相關(guān)的機(jī)制主要是因?yàn)镋GFR通過結(jié)合其配體，使自身酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，引起細(xì)胞過度增殖，而p53基因是細(xì)胞生長的監(jiān)控器，其阻礙了因EGFR磷酸化作用而引發(fā)的細(xì)胞過度增殖，但是突變的p53基因失去了該功能，導(dǎo)致EGFR磷酸化作用加強(qiáng)，引發(fā)細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而共同促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。綜上所述，IGF-1R、EGFR、p53蛋白在胸腺上皮瘤組織中的表達(dá)水平較高，共同參與了胸腺上皮瘤的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移，對胸腺上皮瘤患者的生存情況也造成了一定的影響，在一定程度上可以作為評估胸腺上皮瘤惡性程度及預(yù)后的有效指標(biāo)。本研究的不足之處在于樣本例數(shù)較少，研究結(jié)果還需在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。