血清及組織內(nèi)HOTAIR 表達在結(jié)腸癌診斷及轉(zhuǎn)移風險識別中的應(yīng)用價值研究

黎武，宋勁松

天門市第一人民醫(yī)院普外1區(qū)湖北天門431700

結(jié)腸癌為40～50歲人群高發(fā)的惡性腫瘤之一［1］。相關(guān)證據(jù)表明［2］，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是中晚期結(jié)腸癌患者死亡的主要原因，即使采取標準治療方案，5年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍高達50%。隨著研究的深入，有研究發(fā)現(xiàn)［3-5］，非編碼基因在多種惡性腫瘤的發(fā)生、進展與轉(zhuǎn)移過程中均發(fā)揮重要作用，如胃癌、大腸癌、胃腸間質(zhì)瘤等。梁思遠的研究發(fā)現(xiàn)［6］，長鏈非編碼RNA 參與順式調(diào)控、反式調(diào)控、轉(zhuǎn)錄激活、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N基因轉(zhuǎn)錄過程，可作為生物標志物，而異常表達的長鏈非編碼RNA可預(yù)測腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。同源基因的轉(zhuǎn)錄反義RNA （homeotic genes transcript antisense RNA，HOTAIR）是第1 個被發(fā)現(xiàn)的通過表觀遺傳調(diào)控致癌的長鏈非編碼RNA［7］，但目前其在結(jié)腸癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移中的作用機制尚不明確，有關(guān)結(jié)腸癌患者血清中HOTAIR 表達的相關(guān)研究鮮有報道。本研究檢測了56 例結(jié)腸癌患者的血清及癌組織HOTAIR表達，并將血清HOTAIR表達與健康體檢者進行比較，探討血清及組織內(nèi)HOTAIR 表達在結(jié)腸癌診斷及轉(zhuǎn)移風險識別中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年1月期間于本院就診并接受手術(shù)的結(jié)腸癌患者56 例為研究對象，均經(jīng)術(shù)后病理證實為結(jié)腸癌，排除合并其他部位腫瘤者。結(jié)直腸癌患者中男性39例，女性17例；年齡45～77歲，平均（60.89±9.58）歲；術(shù)后病理判斷TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅳ期11例；29例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，27 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另隨機選擇同期來本院進行體檢的健康體檢者56 例為對照組。其中男性35 例，女性21 例；年齡37～72 歲，平均（58.50±9.21）歲。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），具有可比性。研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）病理確診為結(jié)腸癌；（2）年齡40～80 歲。排除標準：（1）既往惡性腫瘤病史；（2）合并心衰、心肌梗死等嚴重心臟疾病；（3）惡性貧血、感染性疾病等其他嚴重內(nèi)科疾病；（4）采集前接受過腫瘤輔助治療；（5）合并免疫性疾病。

1.3 方法

1.3.1 儀器及試劑5×g DNA Eraser buffer、CelmiR-39、gDNA Eraser、2×SYBR Premix Ex Taqtm、PrimeScript Enzyme、Nuclease free H2O（購自大連Ta-KaRa 公司）；氯仿、異丙醇、乙醇均購自重慶川東化工；TRIzol LS（美國Invitrogen公司）；無酶水洗滌核酸蛋白測定儀（美國Thermo公司）；低溫冷凍離心機（美國Beckman公司Allagra-64R型）；微量臺式高速冷凍離心機（美國Beckman 公司Micro-21R 型）；實時熒光定量qPCR儀（新加坡ABI公司）；Veriti-96型PCR儀（新加坡Life公司）。

1.3.2 組織內(nèi)樣本RNA 提取于術(shù)中獲取患者結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織，分割成直徑約0.5 cm 的組織塊，充分碾磨、混勻，吸取碾磨碗中TRIzol 試劑至無酶離心管內(nèi)，將200 μL 氯仿試劑，混勻，待10 min 后置于低溫高速離心機內(nèi)，4 ℃，12 000 rmp離心15 min，吸取上清液400 μL在新無酶離心管內(nèi)，加入400 μL異丙醇溶液，混勻放置8 min，在低溫離心機內(nèi)4 ℃，12 000 rmp 離心10 min，棄上清，將1 mL75%乙醇溶液加入，輕振蕩混勻，再置入離心機內(nèi)4 ℃，7 500 rmp，離心5 min，棄上清，放入低溫離心機內(nèi)4 ℃，7 500 rmp，離心30 s，將多余乙醇吸棄，室溫下干燥，每管內(nèi)加50 μL DEPC無酶水。無酶水洗滌核酸蛋白測定儀檢測RNA 溶度，吸取1.5 μL樣本至核酸蛋白測定儀內(nèi)，檢測RNA濃度。

1.3.3 血清RNA提取采集結(jié)腸癌患者與健康體檢者的5 mL 外周靜脈血，置于促凝管中，離心（2 500 r/min，15 min）后留取上清液置于無酶離心管，在-80 ℃下保存，室溫融化吸取250 μL 在無酶離心管內(nèi)，將750 μL TRIzol LS試劑，混勻，將10 μL 0.2 μmol/mL 線蟲Cel-miR-39，混勻，加200 μL 氯仿試劑，混勻，放置10 min 后在低溫高溫離心機內(nèi)4 ℃，12 000 rmp離心15 min，吸取上清液400 μL在新的無酶離心管內(nèi)，加400 μL 異丙醇溶液，混勻靜置8 min，低溫離心，4 ℃，12 000 rmp，離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇，輕柔振蕩混勻，低溫離心，4 ℃，7 500 rmp，離心5 min 后棄上清，吸棄多余乙醇，室溫干燥，每管加20 μL 65 ℃DEPC無酶水溶液RNA。

1.3.4 qRT-PCR 檢測組織內(nèi)HOTAIR 表達采用qRT-PCR 檢測，組織樣本總RNA 以無酶水稀釋1 μg，根據(jù)以下反應(yīng)體系加入，5×g DNAEraser buffer（2 μL）、 1 μL gDNAEraser （1 μL）、 TotalRNA（1μg），反應(yīng)條件：混勻，45 ℃，1min，后繼續(xù)加入試劑：5×PrimeScriptEnzymeBuffer （4 μL）、Prime-ScriptEnzyme （1μL）、PrimeScriptRT Mix （1 μL）、Nucleasefree H2O（4 μL），混勻，37 ℃，15 min，得cDNAs。qPCR擴增條件：2×SYBRPremix Ex Taqtm（5 μL）、PrimerForward（0.2 μL）、Primer Reverse（0.2 μL）、ROXDye Ⅱ（0.2 μL）、Nucleasefree H2O（2.4 μL）、cDNA（2 μL），行ABIstepone擴增，采集熒光。

1.3.5 檢測血清HOTAIR 表達逆轉(zhuǎn)錄：HOTAIR逆轉(zhuǎn)錄引物的上游序列：5'-GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'；HOTAIR 逆轉(zhuǎn)錄引物的下游序列：5'-ACACAAAGTGCATACCTACCCA-3'。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、預(yù)擴增（2×SYBRPremixExTaqtm5 μL、PrimerForward 0.2 μL、Primer Reverse 0.2 μL、NucleasefreeH2O 2.6 μL、cDNA 2 μL，混勻，95 ℃，2 min，14 循環(huán)后95 ℃15 sec，58 ℃下30 sec，溶解溫度，由58 ℃加至95 ℃，獲得預(yù)擴增產(chǎn)物）、qPCR擴增（2×SYBR Premix Ex Taqtm5 μL、Primer Forward 0.2 μL、Primer Reverse 0.2 μL、Nuclease free H2O 2.4 μL、ROX DyeⅡ0.2 μL，預(yù)擴增產(chǎn)物2 μL）、擴增內(nèi)參（ABI stepone擴增，混勻后95 ℃2 min，40 個循環(huán)，在95 ℃反應(yīng)15 sec，58 ℃反應(yīng)30 sec，58 ℃時采集熒光，溶解，由58 ℃加至95 ℃，持續(xù)采集熒光，每加0.5 ℃采集1次），上述步驟完成后采用Comparative Dleta-delta Ct法測定血清中HOTAIR表達的定量結(jié)果，以mRNA相對表達值（HOTAIR/Cel-miR-39）表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁正常組織中HOTAIR的表達

癌組織中HOTAIR 的mRNA 相對表達值為（25.41±6.10），高于癌旁正常組織的（6.37±1.59），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。癌組織和癌旁正常組織HOTAIR熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線如圖1。

圖1 癌組織和癌旁組織HOTAIR熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線

2.2 臨床分期與血清HOTAIR表達的相關(guān)性

Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值為（57.20±10.96），高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌患者的（20.21±6.72）與健康體檢者的（17.63±5.75），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 262.266，P ＜0.001；LSD -tⅢ、Ⅳ期vs.Ⅰ、Ⅱ期=18.461， PⅢ、Ⅳ期vs.Ⅰ、Ⅱ期＜ 0.001；LSD-tⅢ、Ⅳ期vs.健康體檢者=22.071，PⅢ、Ⅳ期vs.健康體檢者＜0.001）。健康體檢者血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值與Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌患者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（LSDt健康體檢者vs.Ⅰ、Ⅱ期=1.546，P健康體檢者vs.Ⅰ、Ⅱ期＞0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，血清HOTAIR表達與臨床分期之間呈正相關(guān)（r=0.625，P=0.003）。見圖2。

圖2 血清HOTAIR在健康體檢者與不同臨床分期患者的表達

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與血清HOTAIR表達的相關(guān)性

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值為（52.89±9.67），高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的（28.69±6.44）與健康體檢者的（17.63±5.75），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值高于健康體檢者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F =234.928，P ＜0.001；LSD-t淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs.非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移= 12.722，P淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs.非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移＜0.001；LSD-t淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs.健康體檢者=21.667，P淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs.健康體檢者＜0.001；LSD-t非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs.健康體檢者=6.636，P非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs健康體檢者＜0.001）。Spearman 相關(guān)分析顯示，血清HOTAIR表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)性（r=0.772，P ＜0.001）。見圖3。

圖3 血清HOTAIR在健康體檢者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移患者的表達

2.4 血清HOTAIR 表達對結(jié)腸癌診斷與轉(zhuǎn)移的評估價值

血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值診斷結(jié)腸癌的臨界值為（20.50±3.98），診斷敏感度0.818，特異度0.794。血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨界值為（32.46±5.85），診斷敏感度0.750，特異度0.889。見圖4、圖5。

圖4 血清HOTAIR診斷結(jié)腸癌的ROC曲線

圖5 血清HOTAIR判斷結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

HOTAIR位于哺乳動物細胞染色體，是第1個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長鏈非編碼RNA。HOTAIR的作用及分子機制雖然尚未完全明確，但其在惡性腫瘤中發(fā)揮的作用已引起臨床重視。

有研究表明［8］，HOTAIR是表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控的結(jié)腸癌相關(guān)長鏈非編碼RNA，癌組織的HOTAIR 表達情況或與結(jié)腸癌浸潤深度、血管侵犯、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等有關(guān)。本研究將結(jié)腸癌患者癌組織與癌旁正常組織的HOTAIR表達量進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中HOTAIR 的mRNA 相對表達值為（25.41±6.10），高于癌旁正常組織的（6.37±1.59），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），提示癌組織中HOTAIR 表達可能與腫瘤行為有關(guān)。但朱州等［9］的研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌癌組織與癌旁正常組織的HOTAIR 表達差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，筆者考慮其與本文結(jié)果不同的原因可能是與所采用的擴增引物不同有關(guān)。HOTAIR 主要通過DNA 甲基化、蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)等途徑抑制多種抑癌基因表達，從而促使腫瘤發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移［10］。尹磊等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR 表達下調(diào)可減弱腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。且有研究發(fā)現(xiàn)［12］，HOTAIR 下調(diào)后腫瘤對化療藥物的敏感性隨之提高，可為腫瘤個體化治療提供新的靶點。錢力等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞系中敲除HOTAIR 基因后，人基質(zhì)金屬蛋白酶-9 與血管內(nèi)皮生長因子表達大幅下調(diào)，HOTAIR基因可能通過對上述兩種蛋白的調(diào)節(jié)來增強腫瘤細胞的增殖。提示HOTAIR 異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，與本文的結(jié)果相一致。

本研究對結(jié)腸癌患者血清中HOTAIR 表達進行分析，發(fā)現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者血清HOTAIR 的mRNA 相對表達值高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌患者與健康體檢者，尤其Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者的血清HOTAIR異常高表達，且血清HOTAIR 表達與臨床分期呈正相關(guān)，臨床分期越高，血清HOTAIR 表達越高，這與HOTAIR 參與細胞凋亡調(diào)控、細胞生長與侵襲調(diào)控等過程有關(guān)［14］。通過繪制血清HOTAIR 的mRNA相對表達值診斷結(jié)腸癌的ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，臨界值為（20.50±3.98）時診斷敏感度為0.818，特異度0.794，表明血清HOTAIR 表達對于結(jié)腸癌具有良好診斷價值。劉浩等［15］發(fā)現(xiàn)，HOTAIR 在腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的表達高均于正常對照組，且轉(zhuǎn)移灶中HOTAIR表達更高，提示HOTAIR 與腫瘤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。靖琳等［16］的研究認為，HOTAIR 是通過上皮間質(zhì)途徑促進結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究中，不論是有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者還是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，血清HOTAIR的mRNA 相對表達值均較健康體檢者呈高表達，血清HOTAIR 表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間正相關(guān)，提示血清HOTAIR 表達對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有一定的預(yù)測價值，當HOTAIR 的mRNA 相對表達值高于（32.46±5.85）時，其判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度0.750，特異度0.889，提示其預(yù)測價值較好。值得注意的是，長鏈非編碼RNA 長度較長，在外周血中可能會斷裂成小段而出現(xiàn)擴增不成功的情況，故檢測血清中HOTAIR表達時應(yīng)注意引物序列的選擇，可針對不同片段設(shè)計不同引物。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清及組織內(nèi)HOTAIR均異常表達，癌組織HOTAIR 表達高于癌旁正常組織，而結(jié)腸癌患者血清HOTAIR 表達也高于正常人群，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為結(jié)腸癌診斷及轉(zhuǎn)移的評估參考指標。