卵細(xì)胞體外成熟(IVM)在小鼠生物凈化中的應(yīng)用*

杜江濤 武曉靜 戴方偉 盧領(lǐng)群 周莎桑 應(yīng)華忠 郭紅剛

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013)(2.杭州市中醫(yī)院，杭州 310007)

隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，越來越多的轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用到科學(xué)研究中。而在轉(zhuǎn)基因小鼠制備、飼養(yǎng)、運(yùn)輸及品系共享等過程中，極易造成病原微生物的感染，生物凈化是目前去除病原微生物感染的有效途徑[1]。

生物凈化主要有剖宮取胎和體外受精-胚胎移植兩種方法。剖宮取胎操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但存在凈化不徹底和難以計(jì)算最佳剖宮時(shí)間等弊端；而體外受精-胚胎移植則需要掌握扎實(shí)的胚胎移植技術(shù)[2]。

體外受精-胚胎移植法在實(shí)際應(yīng)用中需要大量的成熟卵子，但在超排過程中，由于小鼠年齡、品系、激素用量等許多因素的影響，常常會(huì)出現(xiàn)超排失敗或只有少量成熟卵子排出的現(xiàn)象，造成凈化失敗。這對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠，特別是一些珍稀轉(zhuǎn)基因品系來說，是一種巨大的資源浪費(fèi)。本文旨在利用卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)(invitromaturation,IVM)，深度挖掘未排卵小鼠卵巢內(nèi)未成熟卵的發(fā)育潛力，以提高珍稀轉(zhuǎn)基因小鼠的卵子利用率，同時(shí)也作為常規(guī)促排卵失敗的一種補(bǔ)救措施。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

實(shí)體顯微鏡(LEICA,S8AP0)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)。

α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液(M4526，Sigma)；胎牛血清(22011-8612，浙江天杭生物科技股份有限公司)；丙酮酸鈉(P4562，Sigma)；M2培養(yǎng)液(M1250，南京愛貝生物科技有限公司)；獲能液/體外受精液(MR-070-D，Millipore)；胚胎發(fā)育液(MR-121，Millipore)；PMSG(160926)和HCG(160820)均購(gòu)自寧波第二激素廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

待凈化轉(zhuǎn)基因小鼠，雌鼠4～6周齡，雄鼠8周齡，來源于科研用小鼠。

清潔級(jí)ICR小鼠，雌鼠4～6周齡，雄鼠6～8周齡。來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，使用許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。

以上動(dòng)物均飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)隔離包內(nèi)，動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)：SYXK(浙)2014-0008。自由采食飲水，光照12 h/d(7:00-19:00)。

1.3 結(jié)扎公鼠的制備

6～8周齡ICR雄鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后切開下腹部皮膚和肌肉，暴露兩側(cè)輸精管，無菌彎鑷在酒精燈火焰上燒燙后迅速將輸精管夾斷。將斷開的輸精管小心放置原位，撒上少許青霉素粉后縫合肌肉皮膚，1個(gè)月后使用。

1.4 小鼠超排

實(shí)驗(yàn)分組：A組：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡內(nèi)未成熟卵體外培養(yǎng)；B組：只注射PMSG，48 h后取卵泡內(nèi)未成熟卵體外培養(yǎng)；C組：注射PMSG和HCG后，輸卵管內(nèi)取成熟卵(正常超排組)直接進(jìn)行體外受精；D組：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢，取卵泡內(nèi)裸卵和疑似成熟卵體外培養(yǎng)。下文均簡(jiǎn)稱A組、B組、C組和D組。

下午5點(diǎn)，小鼠4周齡5 IU/只，5～6周齡7.5 IU/只，腹腔注射PMSG，48 h后注射相同劑量HCG，16～18 h后收集成熟卵母細(xì)胞、未成熟卵母細(xì)胞、裸卵和疑似成熟卵。只注射PMSG組則在注射PMSG 46～48 h后取未成熟卵，體外成熟培養(yǎng)16～18 h后進(jìn)行體外受精與體外胚胎培養(yǎng)(具體方法詳見1.6)。

1.5 培養(yǎng)基準(zhǔn)備

體外成熟培養(yǎng)液按參考文獻(xiàn)配制，主要成分為：α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，5%胎牛血清(FBS)，3ng/mL EGF，50mIU/mL rhFSH，0.25 mmol/L丙酮酸鈉，青霉素與鏈霉素各0.5%[3]，0.2 μm濾膜過濾后分裝冷凍備用。

采卵前一天，用直徑35 mm培養(yǎng)皿分別做IVM液、獲能液/受精液、KSOM培養(yǎng)液等液滴，上覆石蠟油，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜孵育。

1.6 精子獲能、體外受精與未成熟卵IVM

1.6.1精子獲能：采卵前1 h，頸椎脫臼處死雄鼠，在1∶200稀釋萬潔消毒液中浸泡消毒，置于干凈衛(wèi)生紙上吸干液體。無菌手術(shù)器械取其兩側(cè)附睪尾，剔除多余脂肪組織，在無菌濾紙上來回滾動(dòng)數(shù)次除去血漬，放入提前過夜孵育的獲能皿的石蠟油中。用無菌鑷夾住附睪尾使其繃緊，并用1 mL無菌注射器針頭刺破附睪尾，將溢出的精液移到獲能液滴中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中獲能1 h。

1.6.2體外受精：凈化用轉(zhuǎn)基因雌鼠，HCG注射16～18 h后，頸椎脫臼處死，1∶200稀釋萬潔消毒液中浸泡消毒，取其兩側(cè)卵巢和輸卵管，將其置于提前預(yù)熱至37 ℃的M2培養(yǎng)液中。M2培養(yǎng)液中再次清洗后，放在無菌濾紙上吸干液體，然后轉(zhuǎn)到提前過夜孵育的受精液滴皿的石蠟油中?？拷芫旱?，找到輸卵管膨大部，用1 mL無菌注射器劃破膨大部，將卵子移到受精液滴中。未見膨大部的卵巢則置于M2培養(yǎng)液中，37 ℃保溫備用。

取在培養(yǎng)箱中獲能1 h的獲能液滴皿，顯微鏡下檢查精子活力和精子數(shù)量。用移液器吸取獲能液滴周邊精子10 μL(約含精子200個(gè)/μL)，加入到已移入卵子的受精液滴中(50～100個(gè))。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中受精4 h，然后將所有卵子轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育液KSOM中。

1.6.3未成熟卵IVM：取M2中保存的未超排卵巢，實(shí)體顯微鏡下用鑷子將卵巢周邊的脂肪及輸卵管剝離干凈，M2中清洗2～3次后，轉(zhuǎn)入事先37 ℃預(yù)熱的α-MEM中。用1 mL注射器針頭劃破卵泡，釋放卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。無菌玻璃管在酒精燈火焰上烤熱熔化后迅速拉至直徑比COCs稍粗的玻璃針(提前準(zhǔn)備)，用口吸管吸取至少有3層顆粒細(xì)胞包裹的COCs，轉(zhuǎn)至另一皿干凈的α-MEM中。撿卵結(jié)束后將所有的COCs轉(zhuǎn)至事先在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜孵育的IVM液滴中，清洗2～3次后轉(zhuǎn)至200 μL大液滴，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h，然后進(jìn)行體外受精。精子獲能、體外受精方法同上。體外受精4 h后轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育液KSOM中。

取注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡內(nèi)的裸卵和疑似成熟卵(卵丘顆粒細(xì)胞已擴(kuò)散)，分為三組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：直接受精；體外成熟培養(yǎng)6 h后受精和體外成熟培養(yǎng)16～18 h后受精。受精4 h后轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育液KSOM中。

1.7 受體小鼠的挑選、合籠與胚胎移植

體外受精當(dāng)天下午5點(diǎn)左右，挑取陰門紅腫發(fā)情的ICR雌鼠，與結(jié)扎雄鼠1∶1合籠交配。于次日早上挑取有陰栓的小鼠(即受體小鼠)，無菌環(huán)境下從隔離包轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)。

受體小鼠1%戊巴比妥鈉麻醉，背部剃毛，75%酒精，碘酊再75%酒精消毒。在卵巢位置剪一縱向小口，依次剪開皮膚、肌肉、腹膜后，用鑷子找到脂肪墊，將其和卵巢、輸卵管一起拉出。用脂肪夾夾住脂肪墊，固定好卵巢和輸卵管，在顯微鏡下找到輸卵管膨大部并將其調(diào)整至最高位。玻璃針最前端吸取3個(gè)氣泡，然后吸取20～30個(gè)2-細(xì)胞胚，在輸卵管膨大部前端進(jìn)針，將2-細(xì)胞胚吹至膨大部。當(dāng)三個(gè)氣泡均吹至膨大部時(shí)，說明全部2-細(xì)胞胚已經(jīng)移植到輸卵管膨大部?jī)?nèi)。

2 結(jié)果

2.1 A組和B組與C組卵細(xì)胞體外成熟率、二胞率、囊胚率及出生率

注射PMSG和HCG后，未排卵卵巢(A組)，取卵泡內(nèi)未成熟卵體外培養(yǎng)，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其成熟率為：88.6%(62/70)，83.3%(45/54)，89.2%(66/74)。二胞率為：67.1%(47/70)，42.6%(23/54)，55.4%(41/74)。13枚二細(xì)胞胚胎體外發(fā)育，有3枚發(fā)育至囊胚，囊胚發(fā)育率為23.1%(3/13)。將41枚二細(xì)胞胚胎移植到2只受體鼠體內(nèi)，其中1只生出5只幼崽，產(chǎn)仔率為12.2%(5/41)。

只注射PMSG，48 h后取卵泡內(nèi)未成熟卵(B組)，4次體外成熟培養(yǎng)，其成熟率為：79.3%(65/82)，88.1%(140/159)，82.4%(131/159)，86.0%(92/107)。二胞率為：59.8%(49/82)，44.0%(70/159)，43.4%(69/159)，59.8%(64/107)。囊胚率為：36.7(18/49)，58.6(41/70)，30.4(21/69)，28.1(18/64)。

注射PMSG和HCG后，輸卵管內(nèi)取成熟卵(C組)，直接進(jìn)行體外受精，受精后二胞率為：79.5%(167/210)，79.0%(233/295)，78.3%(195/249)。囊胚率為：73.7%(123/167)，79.8%(186/233)，80.5%(157/195)。見表1。

A組與B組相比，其成熟率和二胞率均無顯著性差異(P>0.05)。A組二胞率與C組相比，有顯著性差異(P<0.05)。B組二胞率與C組相比，有極顯著性差異(P<0.01)。A組和B組與C組相比，囊胚率均有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 A組、B組和C組卵細(xì)胞體外發(fā)育結(jié)果Table 1 Oocytes in vitro development results of group A,B and C.

2.2 D組不同成熟培養(yǎng)時(shí)間卵細(xì)胞體外成熟率、二胞率及囊胚率

注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢，取卵泡內(nèi)裸卵和疑似成熟卵(D組)，體外成熟培養(yǎng)時(shí)間分為三組：成熟培養(yǎng)0 h(即直接進(jìn)行體外受精)；成熟培養(yǎng)6 h和成熟培養(yǎng)16～18 h。受精后成熟培養(yǎng)0 h兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)二胞率為10.2%、15.6%，囊胚率為0.0%、22.7%；成熟培養(yǎng)6 h二胞率為5.7%，囊胚率為0.0%；成熟培養(yǎng)16～18 h兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)二胞率為1.3%、18.6%，囊胚率為0.0%、3.3%。(詳見表2)。

表2 D組卵細(xì)胞體外發(fā)育結(jié)果Table 2 Oocytes in vitro development results of group D

D組中體外成熟培養(yǎng)0 h、6h和16～18 h，其二胞率和囊胚率與組A、B、C相比均有極顯著性差異。

3 討論

3.1 超數(shù)排卵

通過超數(shù)排卵獲得大量整齊優(yōu)質(zhì)的卵子是生物凈化、轉(zhuǎn)基因、克隆等研究的基礎(chǔ)之一。影響超排的因素有很多，如：供體雌鼠的品系、年齡與體質(zhì)量、激素的注射劑量和注射時(shí)間、環(huán)境因素(溫度、濕度和噪聲)等[4]。

我們?cè)谠囼?yàn)中，對(duì)不同品系小鼠一律采用：3～4周腹腔注射5 IU PMSG和HCG；5～6周注射7.5 IU PMSG和HCG；而對(duì)7周及以上則注射10 IU PMSG和HCG，兩種激素注射間隔時(shí)間均為48 h。結(jié)果表明，C57BL/6 J小鼠超排效果最好且穩(wěn)定。宋紹征等[5]研究發(fā)現(xiàn)在相同劑量激素條件下，ICR小鼠和C57BL/6 J小鼠的超排效果顯著優(yōu)于BALB/c小鼠和FVB小鼠，我們?cè)囼?yàn)結(jié)果與其相一致，原因可能是近交系的遺傳因素導(dǎo)致BALB/c、FVB、129等小鼠的繁殖能力較差。

3～4周小鼠相較于其它周齡小鼠，可獲得最好的超排效果，這與徐平[6]的研究結(jié)果相一致，這可能是性成熟后的小鼠固有的性周期和性激素對(duì)外源性的超排激素(PMSG和HCG)有影響。

關(guān)于小鼠超排最合適的激素用量，目前國(guó)外多采用eCG/PMSG和HCG各5IU或各7.5IU劑量[3, 7-9]，國(guó)內(nèi)有的采用PMSG和HCG各5IU或各10IU劑量。而我們?cè)谠囼?yàn)過程中，則根據(jù)小鼠年齡體質(zhì)量的不同做了適當(dāng)調(diào)整。

年齡較大雌鼠和一些近交系小鼠(BALB/c、FVB、129等)的超排效果一直較差，甚至無排卵，正是這些問題的存在，迫使我們尋找一種新的方法來提高卵子利用率，卵母細(xì)胞體外成熟則為解決這一問題提供了新的途徑。

3.2 卵母細(xì)胞體外成熟

卵母細(xì)胞體外成熟(invitromaturation,IVM)是一項(xiàng)重要的輔助生殖技術(shù)和研究工具。因其可以生產(chǎn)成熟卵子被廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域，如：人類不孕癥治療、家畜人工育種中的胚胎生產(chǎn)、克隆、干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等[9]。

小鼠卵母細(xì)胞體外成熟一般是在注射eCG/PMSG 44或48 h后直接從卵泡中取未成熟卵體外培養(yǎng)[10-12]，而我們?cè)谏飪艋袆t是針對(duì)注射PMSG和HCG后未排卵的卵巢。為了比較注射HCG對(duì)卵巢卵泡內(nèi)未成熟卵體外發(fā)育的影響，我們?cè)O(shè)置了兩組試驗(yàn)：注射PMSG和HCG后未排卵組(A組)和只注射PMSG，48 h后取未成熟卵組(B組)，同時(shí)以注射PMSG和HCG后正常超排卵組(C組)作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：注射HCG對(duì)卵泡內(nèi)未成熟卵體外成熟、體外受精、體外胚胎發(fā)育等并無影響，A組與B組的成熟率、二胞率均無顯著性差異(P>0.05)。因A組體外受精后大部分二細(xì)胞胚胎用于移植，只有很少一部分(13枚)用來做體外胚胎發(fā)育，所以A組與B組的囊胚率并無可比性。A組的二細(xì)胞胚胎做了3次移植試驗(yàn)，分別移植34、23和41枚二細(xì)胞胚，但因受體等各種因素的影響，只成功了一次。41枚二細(xì)胞胚移植到兩只受體小鼠輸卵管內(nèi)，其中一只成功受孕生出5只小鼠(2雄3雌)，5只小鼠性成熟后相互交配可產(chǎn)下正常的后代，說明通過IVM技術(shù)出生的小鼠是健康可育的[13]。

但是，注射HCG可導(dǎo)致超排后的卵巢質(zhì)地松軟，卵巢表面缺少較好的卵泡，卵泡內(nèi)部大部分為裸卵或卵丘顆粒細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散的卵(疑似成熟卵)。與只注射PMSG相比，注射HCG后獲得的質(zhì)量較好的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs，至少有三層顆粒細(xì)胞包裹)大大減少。但是只要有顆粒細(xì)胞包裹的COCs，在體外成熟培養(yǎng)16～18 h后，顆粒細(xì)胞均會(huì)擴(kuò)散，經(jīng)體外受精后大部分可卵裂至二細(xì)胞胚胎，其成熟率和受精率均較理想。

A組、B組與正常超排卵對(duì)照組(C組)相比，卵細(xì)胞成熟率、二胞率和囊胚率均有顯著性差異，說明在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，卵細(xì)胞體外成熟仍不能完全模擬其體內(nèi)發(fā)育環(huán)境和條件，對(duì)卵細(xì)胞成熟的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

PMSG和HCG注射后未排卵卵巢，卵泡內(nèi)有大量裸卵和疑似成熟卵(卵丘顆粒細(xì)胞已擴(kuò)散卵)，為了進(jìn)一步挖掘這部分卵子的利用價(jià)值，我們分三組進(jìn)行試驗(yàn)：體外成熟培養(yǎng)0 h(直接進(jìn)行體外受精)、體外成熟培養(yǎng)6 h后體外受精和體外成熟培養(yǎng)16～18 h后體外受精。直接進(jìn)行體外受精組，兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，受精后二胞率分別為15.6%(22/141)和10.2(5/49)，囊胚率分別為22.7%(5/22)和0%(0/5)。說明在這些裸卵和疑似成熟卵中，有真正的成熟卵，但只是占很少一部分比例。體外成熟培養(yǎng)6 h組二胞率為5.7%(3/53)，囊胚率為0%(0/3)；體外成熟培養(yǎng)16～18 h組，兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，二胞率分別為18.6%(30/161)和1.3%(1/79)，囊胚率分別為3.3%(1/30)和0%(0/1)。說明在這些裸卵和疑似成熟卵中，只有很少一部分可以在體外成熟培養(yǎng)后獲得受精能力。不管是直接進(jìn)行體外受精，還是體外成熟培養(yǎng)6 h、16～18 h后進(jìn)行體外受精，裸卵和疑似成熟卵受精后的二胞率、囊胚率都不盡如人意。分析其原因可能是這部分卵子，由于沒有卵丘顆粒細(xì)胞的包裹，所以在體外成熟培養(yǎng)中不能很好地接受成熟因子的調(diào)控[8]。然而，只注射PMSG(B組)的卵泡中，大部分是有顆粒細(xì)胞包裹的未成熟卵，裸卵只有很少一部分，并且未見到有疑似成熟卵。由此得出結(jié)論：注射PMSG和HCG后未排卵卵巢卵泡內(nèi)大量的裸卵和疑似成熟卵是HCG作用的結(jié)果，至于為什么沒有排出原因尚不清楚。

綜上所述，卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)可以作為生物凈化中小鼠促排卵失敗的一種補(bǔ)救措施，并且可以提高一些珍稀轉(zhuǎn)基因品系小鼠的卵子利用率。