蘇木精-伊紅染色制作骨骼肌組織教學(xué)切片的方法優(yōu)化

吳怡嫻，董娟娟，瑪依熱·吐爾洪，李琴，許彭，李秀梅

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)中心 ，新疆烏魯木齊 830011）

骨骼肌組織形態(tài)觀察是組織學(xué)實驗教學(xué)中的一項重要內(nèi)容。在骨骼肌的肌原纖維上明暗相間的橫紋結(jié)構(gòu)是本科教學(xué)大綱中必須要求掌握的內(nèi)容，也是形態(tài)學(xué)科研和臨床病理重要的觀察內(nèi)容。實驗教學(xué)中骨骼肌通常采用常規(guī)的蘇木精-伊紅染色法（HE染色法）。在HE染色中，橫紋結(jié)構(gòu)在不同種屬以及切片厚度之間是否有差異，目前報道不多。我們將人、兔、狗的骨骼肌結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡下做了比較，并對狗的骨骼肌組織在不同切片厚度的情況下橫紋結(jié)構(gòu)的差異進行篩選，為獲得合格的骨骼肌組織教學(xué)切片提供指導(dǎo)。

材料與方法

1 材料和試劑

骨骼肌組織分別來源于人、兔子及狗的四肢，蘇木素染液、伊紅染液均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

2 石蠟切片制備

骨骼肌組織置于4%甲醛水溶液內(nèi)固定，24h后更換新鮮固定液，繼續(xù)固定1～2d后，將組織塊置于自來水下沖洗，采用梯度乙醇溶液脫水、二甲苯透明、石蠟（60℃）浸潤2h后包埋成蠟塊。Leica RM2235切片機切片，切片厚度分為2μm、3μm、4μm、5μm、6μm， 45℃蒸餾水中展片、裱片，60℃烘片干燥。

3 染色及封片

二甲苯脫蠟，無水乙醇、95%、90%、80%、70%梯度乙醇脫二甲苯，蘇木素染液染細胞核10min，蒸餾水水洗，1%鹽酸酒精分色，自來水藍化5min，光鏡下檢查細胞核分色質(zhì)量，伊紅染液染細胞質(zhì)2～5min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明各、中性樹膠封片。

結(jié) 果

1 不同種屬之間骨骼肌橫紋結(jié)構(gòu)差異

高倍光鏡觀察顯示，人的骨骼肌纖維較細，肌原纖維排列整齊，橫紋結(jié)構(gòu)明暗相間較細密（圖1A）；兔的骨骼肌肌原纖維明顯，但橫紋結(jié)構(gòu)僅在部分肌原纖維上隱約顯示（圖1B）；狗的骨骼肌肌原纖維平行整齊緊密排列，橫紋結(jié)構(gòu)明顯，清晰可見（圖1C）。

圖1 人（A）、兔（B）和狗（C）骨骼肌HE染色。比例尺，20μmFig. 1 HE staining of the skeletal muscles of human (A), rabbit (B) and dog (C). Scale bar, 20μm

2 狗骨骼肌切片不同厚度對HE染色橫紋結(jié)構(gòu)顯示的影響

在不同厚度的狗的正常骨骼肌組織切片中，骨骼肌肌原纖維及橫紋結(jié)構(gòu)存在差異：厚度2μm的切片中，骨骼肌肌原纖維及橫紋結(jié)構(gòu)幾乎看不到，骨骼肌纖維呈現(xiàn)一片均質(zhì)紅染（圖2A）；厚度3μm切片中骨骼肌肌原纖維呈現(xiàn)，但橫紋結(jié)構(gòu)顯示不清晰（圖2B）；厚度4μm（圖2C）、5μm（圖2D）切片中骨骼肌肌原纖維及橫紋結(jié)構(gòu)清晰可見；厚度6μm切片中骨骼肌切片橫紋結(jié)構(gòu)明顯，但肌原纖維及細胞核重疊，不利于學(xué)生觀察（圖2E）

討 論

組織學(xué)是研究機體正常微細結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能的科學(xué)，觀察組織切片是組織學(xué)的基本學(xué)習方法，合格的實驗教學(xué)切片是組織學(xué)實驗教學(xué)質(zhì)量的重要保障，而實驗教學(xué)切片，對染色的效果、切片存放時間等要求較高[1]。橫紋肌包括骨骼肌和心肌，在制作骨骼肌實驗教學(xué)切片的制作中常出現(xiàn)肌原纖維顯示不清楚，橫紋結(jié)構(gòu)不典型的情況[2-4]。由于人的正常組織來源困難，且需在死亡后4～5h以內(nèi)取新鮮組織，否則就會出現(xiàn)組織自溶，破壞細胞正常結(jié)構(gòu)，而動物的某些組織結(jié)構(gòu)與人體組織結(jié)構(gòu)相近，且組織器官相對容易獲得，故在日常實驗教學(xué)中，往往用動物的器官組織來制作教學(xué)切片。我們比較了人、狗、兔子的骨骼肌組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)狗的骨骼肌組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人的骨骼肌結(jié)構(gòu)相似，骨骼肌纖維成圓柱體，相比兔的骨骼肌結(jié)構(gòu)，肌原纖維排列整齊，橫紋結(jié)構(gòu)更典型，故我們認為狗的骨骼肌組織可以替代人的骨骼肌用于實驗教學(xué)中。為了進一步探討骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)與石蠟切片厚度之間的關(guān)系，我們將狗的骨骼肌組織制作成2μm、3μm、4μm、5μm、6μm的厚度分別進行比較，發(fā)現(xiàn)在HE染色中，厚度為4μm和5μm的狗骨骼肌組織，肌原纖維束排列整齊，橫紋清晰，背景干凈、顏色對比性高，厚度4μm和5μm的狗骨骼肌組織可較好的分辨和觀察骨骼肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。其他厚度的骨骼肌組織切片由于太薄或略厚，導(dǎo)致肌原纖維及橫紋結(jié)構(gòu)不清晰，甚至觀察不到橫紋結(jié)構(gòu)。6μm厚度的骨骼肌組織切片細胞層次不清楚，堆疊嚴重，成像不清楚，難以看到完整細胞形態(tài)。本實驗證明，狗的骨骼肌組織結(jié)構(gòu)與人相似，可以用于教學(xué)切片制作，切片厚度以4～5μm為佳，在HE染色中可以清晰顯示肌原纖維及橫紋結(jié)構(gòu)。優(yōu)化骨骼肌組織取材、切片厚度等條件，可顯著提高骨骼肌組織的制片效率與切片質(zhì)量，為組織學(xué)實驗教學(xué)提供保障。

圖2 不同厚度狗骨骼肌切片中橫紋結(jié)構(gòu)的對比。A，2μm；B，3μm；C，4μm；D，5μm；E，6μm；比例尺，20μmFig. 2 Comparison of cross striation structures in skeletal muscle sections of dog with different thicknesses. A, 2μm; B, 3μm; C, 4μm; D, 5μm; E, 6μm;scale bar, 20μm