誘導型神經(jīng)干細胞移植對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的影響

高謀 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏勻 姚慧 楊志軍

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷性疾病，其流行病學特點呈現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死致殘率，嚴重危害人類生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子可發(fā)揮保護受損傷的神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)細胞修復與再生，減輕TBI后繼發(fā)性腦損傷等多種作用[2,3]。此外，TBI后腦組織內神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達可受多種因素影響，例如，TBI既可激活內源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，也可因破壞組織細胞而減少神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成與分泌[3,4]。由此可見，有效提高TBI后腦組織內神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達水平仍是促進神經(jīng)功能恢復的研究重點[3,4]。筆者曾報道誘導型神經(jīng)干細胞（induced neural stem cells，iNSCs） 移植可促進 TBI動物神經(jīng)功能恢復，并在iNSCs體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其可表達多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF）[5,6]。然而，iNSCs移植物能否在 TBI動物腦組織中表達神經(jīng)營養(yǎng)因子，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用目前尚不明確。為此，本研究用自由落體腦打擊裝置制備C57BL/6小鼠TBI模型，并將C57BL/6小鼠iNSCs經(jīng)立體定向注射到TBI小鼠腦內，于移植后7 d處死動物。取腦組織mRNA行逆轉錄定量實時聚合酶鏈反應（reverse transcription quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR） 檢測 Bdnf和Gdnf基因轉錄水平。隨后，取腦組織蛋白行酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測BDNF和GDNF蛋白表達量。在明確各組TBI動物腦組織中BDNF和GDNF表達量的基礎上，選取iNSCs移植組動物腦組織行免疫熒光染色，并用激光共聚焦顯微鏡觀察iNSCs移植物分泌BDNF和GDNF等情況，以探討經(jīng)腦立體定向移植iNSCs對TBI后神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的影響，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

健康成年雄性C57BL/6小鼠30只，8～10周齡，體質量24～30 g，所有實驗動物（無特定病原體級）均購自北京維通利華公司。

二、主要實驗儀器和試劑

儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱和MultiskanTMMK3酶標儀（Thermo公司，美國），超凈工作臺（ESCO公司，美國），ABI ViiA7TM實時熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems公司，美國），倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡（Leica公司，德國）。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美國），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和RIPA試劑（Sigma公司，美國），QuantScript RT試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，SYBR Green Master Mix試劑盒[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]，小鼠 BDNF ELISA 試劑盒（Promega公司，美國），小鼠GDNF ELISA試劑盒（Santa Cruz Biotechnology公司，美國），BDNF 抗體（工作濃度：5 μL/mL）、GDNF 抗體 （工作濃度：5 μg/mL）（Abcam 公司，美國），Alexa Fluor?555標記驢抗兔IgG抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Life Tech 公司，美國），4’,6-二脒基-2-苯 基 吲 哚 （4’，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（SouthernBiotech 公司，美國）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制備和iNSCs移植

用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，備皮消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，暴露前囟，以lambda縫向喙側2.0 mm、中線偏右側2.0 mm為撞擊點。用自由落體腦打擊裝置，撞針直徑3.0 mm，制備TBI模型。設置假手術（sham）組（9只），僅切開頭皮，不實施撞擊。于傷后1 h對TBI小鼠進行神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity scores，NSS），將 NSS 為 4～8 分者（21 只）納入 TBI組，按照隨機數(shù)字表法分為：iNSCs移植組（12只）和PBS處理組（9只）。于TBI后12 h，再次麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，消毒鋪巾，暴露前囟，以lambda縫向喙側5.0 mm，中線偏右側1.0 mm，硬膜下2.0 mm為注射位點，用25 μL 22 s微量進樣器以0.5 μL/min的速度注射5 μL細胞懸液，細胞總量為1×106個，結束后留針5 min，縫合頭皮。PBS處理組以同樣方式注射等體積PBS。

五、RT-qPCR

細胞移植后7 d采用隨機數(shù)字表法從各組中選取3只動物進行處死，取新鮮腦組織，稱量后，用液氮研磨法提取總RNA。用QuantScript RT試劑盒，按照說明書步驟合成cDNA，并保存于-80℃冰箱內。用SYBR Green Master Mix試劑盒，按照說明書步驟以cDNA作為模板，用ABI ViiA7TM實時熒光定量PCR儀檢測各組動物腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平，以PBS處理組為對照計算各組間mRNA的表達倍數(shù)。

六、ELISA

細胞移植后7 d采用隨機數(shù)字表法從各組中選取6只動物進行處死，取新鮮腦組織，稱質量后，用RIPA試劑提取總蛋白，分裝后保存于-80℃冰箱。用小鼠BDNF ELISA試劑盒和小鼠GDNF ELISA試劑盒，按照說明書步驟操作，用MultiskanTMMK3酶標儀測量蛋白樣品的光密度，用ELISA Calc V軟件計算各組動物腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達水平。

七、腦組織冰凍切片、病理染色和免疫熒光染色

細胞移植后7 d采用隨機數(shù)字表法從iNSCs移植組中選取3只動物進行處死，灌注固定后取出大腦，并作大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚度為10 μm。用蘇木素-伊紅染色觀察腦組織病理形態(tài)學特征。根據(jù)病理染色結果挑選腦組織切片進行免疫熒光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后，分別加入BDNF抗體（工作濃度：5 μL/mL）和GDNF抗體（工作濃度：5 μg/mL）在4℃孵育過夜。 用 PBS漂洗后，分別加入Alexa Fluor?555標記驢抗兔IgG抗體（工作濃度：2 μg/mL），室溫避光孵育 2 h。 用DAPI染細胞核，封片后，用激光共聚焦顯微鏡觀察iNSCs移植物表達BDNF和GDNF等情況。

八、統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達水平以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、INSCs移植物上調TBI小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平

在TBI后7 d，相比sham組，TBI小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，與 PBS 處理組相比，iNSCs移植組TBI小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平明顯升高，2組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。具體信息見表1。

表1 顱腦創(chuàng)傷7 d后的各組小鼠腦組織中Bdnf和Gdnf mRNA 表達倍數(shù)（Mean±SD）

二、INSCs移植物增加TBI小鼠腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達水平

在TBI后7 d，相比sham組，TBI小鼠腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，與PBS處理組相比，iNSCs移植組TBI小鼠腦組織中BDNF和GDNF蛋白表達水平明顯升高，2組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。具體信息見表2。

表2 顱腦創(chuàng)傷7 d后的各組小鼠腦組織中BDNF和GDNF 蛋白表達水平（Mean±SD，pg/mg）

三、INSCs移植物在 TBI小鼠腦組織中表達BDNF和GDNF

在TBI后7 d，iNSCs移植組TBI小鼠腦組織中可見綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的iNSCs移植物從細胞注射位點遷移到達腦損傷區(qū)。此外，在激光共聚焦顯微鏡下可見這些到達腦損傷區(qū)呈GFP陽性的iNSCs移植物表達BDNF和 GDNF（圖 1）。

討 論

TBI后神經(jīng)功能的恢復程度與患者預后密切相關，由于影響CNS損傷后神經(jīng)功能恢復的因素較多，且涉及復雜的病理生理過程，目前尚缺乏綜合有效的治療手段，因而探索促進神經(jīng)功能恢復的療法仍是臨床與基礎研究的重要課題[7-9]。既往認為干細胞移植在CNS損傷性疾病的治療中可發(fā)揮細胞替代作用，從而促進神經(jīng)功能恢復[10,11]。近年來隨著研究深入，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)干細胞不僅可發(fā)揮細胞替代作用，也可通過合成分泌多種物質影響和改善微環(huán)境，為組織細胞的修復與再生創(chuàng)造有利條件[12-15]。筆者曾報道iNSCs移植物可促進TBI動物神經(jīng)功能恢復，行免疫熒光染色可見iNSCs移植物從細胞注射位點逐漸向腦損傷區(qū)遷移，然而由iNSCs分化為成熟的神經(jīng)細胞數(shù)量較少，由此推測iNSCs發(fā)揮細胞替代作用并不能完全解釋TBI后神經(jīng)功能恢復[5,16]。筆者進一步研究發(fā)現(xiàn)，iNSCs移植物可調控TBI后小膠質細胞的活化狀態(tài)，使其由促進炎癥反應類型向促進組織細胞修復類型轉變；此外iNSCs移植物可抑制TBI后反應性星形膠質細胞增生，這些均為神經(jīng)細胞的存活創(chuàng)造了良好的條件[5,16]。除此之外，筆者曾報道iNSCs在體外培養(yǎng)過程中可表達多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如BDNF和GDNF[6]。前已述及，神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過多種途徑發(fā)揮保護受損傷的神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)細胞修復與再生，減輕TBI后繼發(fā)性腦損傷等多種作用，由此可見神經(jīng)營養(yǎng)因子在促進TBI后神經(jīng)功能恢復中具有良好的治療效果[3,4]。然而，iNSCs移植物是否可在TBI后腦組織中合成分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用有待闡明。為此，本課題組探討了iNSCs移植對TBI后神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的影響，結果發(fā)現(xiàn)：CNS損傷后，即在TBI小鼠腦組織中，Bdnf和 Gdnf基因轉錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達水平均明顯降低。這與既往文獻報道，TBI破壞組織細胞可減少神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成與分泌相符合[3,4]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)立體定向移植iNSCs可上調TBI后腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達水平。然而，與sham組相比，iNSCs移植組Bdnf和Gdnf基因轉錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達水平仍明顯降低。說明iNSCs移植物可在一定程度上彌補TBI后神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的不足，然而其是通過自身合成分泌，還是促進內源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達有待進一步闡明。

圖1 顱腦創(chuàng)傷7 d后的iNSCs移植組小鼠腦組織免疫熒光染色檢測（×400）

為探討經(jīng)立體定向移植iNSCs上調TBI后腦組織中Bdnf和Gdnf基因轉錄水平以及BDNF和GDNF蛋白表達水平的作用機制，本研究行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：GFP標記的iNSCs移植物從細胞注射位點向腦損傷區(qū)遷移聚集，這與之前研究報道相符。此外，腦組織中BDNF和GDNF蛋白在iNSCs移植物分布區(qū)呈局部聚集現(xiàn)象，并且BDNF和GDNF蛋白在移植的GFP陽性iNSCs內具有共定位的關系。說明iNSCs移植物可通過合成BDNF和GDNF在一定程度上彌補TBI后神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的不足。結合iNSCs移植組BDNF和GDNF表達水平介于PBS處理組和sham組之間，以及腦組織中iNSCs移植物與BDNF和GDNF蛋白的分布特點，可推測iNSCs移植物主要是通過自身合成分泌BDNF和GDNF為主，目前尚缺乏證據(jù)顯示iNSCs移植物可促進內源性BDNF和GDNF表達。

綜上所述，經(jīng)腦立體定向移植iNSCs可在TBI后腦組織中合成分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和GDNF，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。本研究是基于前期實驗發(fā)現(xiàn)iNSCs在體外培養(yǎng)時可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，進而在TBI動物腦組織中探討iNSCs移植物發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用及相關機制。通過分子生物學及形態(tài)學等實驗研究，筆者發(fā)現(xiàn)iNSCs移植物主要以自身合成分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和GDNF增加TBI后神經(jīng)營養(yǎng)因子表達量，這為分析iNSCs移植療法促進CNS損傷后神經(jīng)功能恢復提供了新的參考依據(jù)。后續(xù)研究筆者將重點關注iNSCs移植物自身合成分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子是否受移植微環(huán)境影響以及iNSCs移植物能否影響內源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，期望通過這一系列研究為體外重編程來源的iNSCs移植治療CNS損傷性疾病打下堅實基礎。