健康斷奶仔豬攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒的流行病學調(diào)查

饒繼紅 何彪 涂長春 張家寧 葛淑敏 龔文杰

摘要 為進一步了解我國規(guī)?；i場健康斷奶仔豬攜帶豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的情況，對2017年采自我國25個?。ㄊ校?8個規(guī)?；i場的斷奶仔豬咽拭子、肛拭子、血清共4 059份樣品進行了高通量測序，然后對檢測到的病毒進行RT-PCR或PCR驗證?；诟咄繙y序的宏基因組學結(jié)果顯示，健康斷奶仔豬的咽拭子、肛拭子、血清中共出現(xiàn)1 706條動脈炎病毒科的病毒基因Reads，其中包括PRRSV。通過RT-PCR擴增從咽拭子和肛拭子中共檢測出46個PRRSV樣品，樣品陽性率為1.1%，豬場陽性率為39.5%。同時，試驗成功擴增出7個毒株的ORF5基因，并進行了序列測定?；贠RF5基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，該試驗獲得的PRRSV流行毒株為高致病性毒株，屬于Type Ⅱ中的Subgroup 4。對健康斷奶仔豬攜帶PRRSV的研究結(jié)果可為豬繁殖與呼吸綜合征的防控提供科學數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）;斷奶仔豬;ORF5;遺傳進化分析

中圖分類號 S852.65+1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）11-0111-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.031

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract To further understand the prevalence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） in healthy weaned piglets of pig farms in China， high throughput sequencing was carried on 4 059 samples from 38 largescale pig farms in 25 provinces （metropolitans） of China， including throat swabs， anal swabs and serum. Then the detected viruses was verified by RTPCR and PCR. Based on the metagenomics results of high throughput sequencing， it was found that 1 706 arteritis virus reads appeared in throat swabs， anal swabs and serum of healthy weaned piglets， including PRRSV. RTPCR results showed that 46 samples were PRRSV positive in throat swabs and anal swabs， the individual positive rate was 1.1% and the herd positive rate was 39.5%. In addition， ORF5 genes of 7 strains were amplified and sequenced. Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences of ORF5 genes showed that the sequenced PRRS viruses belonging to subgroup 4 of Type Ⅱ are closely related to highly pathogenic PRRSV. This study provided scientific basis for the prevention and control of PRRS in China.

Key words Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）;Weaned piglets;ORF5;Phylogenetic analysis

基金項目 “十三五”國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0500104）。

作者簡介 饒繼紅（1993—），女，廣東韶關(guān)人，碩士研究生，研究方向：動物病毒學。

通信作者：葛淑敏，副教授，博士，碩士生導師，從事生物檢測、單克隆抗體制備及特異性菌種篩選等研發(fā)工作;龔文杰，副研究員，博士，碩士生導師，從事動物病毒學的預防控制研究。

收稿日期 2018-12-25

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染疾病，也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）必須上報的動物疫病之一[1-2]。PRRSV屬于套式病毒目（Nidovirales）動脈炎病毒科（Arteriviridae）動脈炎病毒屬（Arterivirus）[3-5]，其基因組大小約為15 kb，由9個重疊的開放閱讀框組成。PRRSV是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，包括8個開放閱讀框（ORFs），其中ORF1編碼的蛋白與RNA 復制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)，非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2基因位于ORF1區(qū)，ORF5編碼重要的保護性抗原糖蛋白GP5。Nsp2和ORF5在PRRSV基因組中變異最大，是科學工作者研究PRRSV分子流行病學及其遺傳衍化規(guī)律常用的基因片段[6]。

PRRSV在美國已經(jīng)流行了30多年，在我國也流行了20余年，它仍然是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原體之一[7]。2006年，在我國高致病性PRRSV的暴發(fā)直接導致了200多萬頭豬死亡[8]。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）具有高致病性和傳染性等特點，一旦傳播就會給我國乃至全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。自2013年以來，由新的PRRSV變異株NADC30-like引起PRRV在我國的再次流行[9-10]。Guo等[11]系統(tǒng)分析了我國PRRSV的流行狀況，闡明了PRRSV-1和PRRSV-2在我國的流行情況。

斷奶仔豬處于一個較敏感的階段，斷奶效應、中斷母體抗體供應以及外在環(huán)境因素的改變都會影響斷奶仔豬的免疫機能，而仔豬的免疫系統(tǒng)一般4～8周才比較完善[12]。雖然我國大部分規(guī)?；i場都會對斷奶仔豬進行PRRSV疫苗免疫，但健康斷奶仔豬是否存在PRRSV持續(xù)性感染現(xiàn)象仍是值得關(guān)注的問題。為了進一步了解我國規(guī)?；i場仔豬攜帶PRRSV的情況，筆者對2017年采集的國內(nèi)?；i場健康斷奶仔豬樣品進行PRRSV檢測和遺傳進化分析，旨在為有效防控PRRSV提供數(shù)據(jù)支持，促進養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品信息及處理。

2017年4—5月，從25個?。ㄊ校┑?8個近1年來無重大疫情的規(guī)?；i場采集1 353頭日齡40～45 d且無臨床癥狀的健康斷奶仔豬的咽拭子、肛拭子和血清，共4 059份，將其分裝于1 mL離心管中，加入高壓滅菌過的PBS（0.02 mol/L，pH 7.4），并將其置于實驗室-80 ℃冰箱中冷凍儲藏，備用。

1.1.2 主要試劑與儀器。

BioFlux Simply 總RNA提取試劑盒，購自北京泰旭國際健康管理中心;2×Taq PCR Master Mix、Reverse Transcriptase M-MLV、 Random Primer，購自天根生化科技有限公司;Prime STAR Max高保真酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker和Agarose等試劑購自TaKaRa公司。

1.1.3 主要儀器。

無菌操作臺（The BAKER COMPANY）、低溫高速離心機（Eppendorf 公司）、制冰機（SANYO 公司）、PCR 儀（BioRad 公司）、電泳儀（BioRad 公司）、凝膠圖像處理系統(tǒng)（BioRad 公司）、-25 ℃冰箱（Haier公司）。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序及病毒宏基因組學分析。

豬場樣本進行混樣（5混1）后，參考He等[13]Sword of Viral Metagenomic（SVM）實驗方法，進行離心取上清液、過濾、核酶消化、核酸提取、sscDNA合成、RNA降解、sscDNA純化、dscDNA合成、寡核酸降解、單引物擴增、DNA檢驗，并進行SVM編號后，38個豬場共計38個SVM宏基因組數(shù)據(jù)庫。由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行高通量測序，并將基于高通量測序的病毒宏基因組學數(shù)據(jù)進行整理分析。

1.2.2 樣品RNA提取。

將“1.1.1”中處理好的咽拭子、肛拭子、血清單樣樣品，分別取100 μL上清液用于RNA提取，具體試驗操作步驟參考BioFlux Simply總RNA提取試劑盒說明書。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 10 μL、隨機引物（1 μmol）1.5 μL、Reverse Transcriptase M-MLV（200 U/μL）1 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）1.5 μL，RRI反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（40 U/μL）0.5 μL，5×M-MLV buffer 4 μL，無RNA酶水補足20 μL。于42 ℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，95 ℃酶滅活5 min，獲得病毒基因組cDNA。

1.2.4 引物設計及合成。

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載各種基因型的PRRSV毒株序列，使用MEGA6.0軟件在NSP2基因保守區(qū)域兩端設計RT-PCR引物，上游引物PRRSV-FP為5′-CGGAAGAAACTGTCGGTG-3′，

下游引物PRRSV-RP為5′-CGCAGACAAATCCAGAGG-3′。ORF5基因擴增的引物序列參照Kang等[14]的研究報道。ORF5基因擴增的上游引物PRRSV-ORF5-FP為5′-AATGAGGTGGGCYACAACC-3′，下游引物PRRSV-ORF5-RP為5′-GCGTGACACCTTAAGGGC-3′。引物送交吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2.5 RT-nPCR進行樣品檢測。

由于樣品數(shù)量大，試驗采用cDNA“5混1”的方法進行RT-PCR檢測，將檢測為陽性的混樣，進一步檢測單樣cDNA。PCR 反應體系（25 μL）如下：2×Taq Mastermix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物PRRSV-FP 1 μL，下游引物PRRSV-RP 1 μL，cDNA模板2 μL。PCR 反應程序如下：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);最后，72 ℃延伸10 min。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，并將陽性產(chǎn)物送交吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.2.6 PRRSV ORF5 基因擴增及測序。

選取陽性樣品cDNA，用高保真酶對ORF5基因進行RT-PCR 擴增。PCR反應條件同“1.2.5”，延伸時間改為 90 s。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，PCR擴增為陽性的產(chǎn)物送至吉林省庫美生物科技有限公司進行純化及測序。

1.2.7 PRRSV ORF5 基因系統(tǒng)發(fā)育樹及同源性分析。

利用MEGA 6.0軟件分析獲得的7條PRRSV ORF5基因序列，繪制系統(tǒng)進化樹分析。此外，利用DNAStar MegAlign與GenBank上收錄的PRRSV參考序列進行同源性比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組學結(jié)果

將采集來自我國25個?。ㄊ校?8個規(guī)?；i場的咽拭子、肛拭子和血清進行高通量測序后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康斷奶仔豬攜帶有動脈炎病毒科等病毒，其中38個SVM宏基因組中有16個SVM宏基因組表出現(xiàn)動脈炎病毒科病毒病毒基因片段，共1 706條Reads（表1）。

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