基于量子點(diǎn)熒光探針的過氧化氫酶活性及酶量的快速測(cè)定

翟晨 王書雅 時(shí)超 黃蔚霞

摘要 [目的]提出一種基于量子點(diǎn)熒光探針的過氧化氫酶活性及酶量檢測(cè)方法。[方法]以谷胱甘肽（GSH）穩(wěn)定的CdTe/CdS量子點(diǎn)為熒光探針，對(duì)過氧化氫酶活性及酶量進(jìn)行定量分析。[結(jié)果]酶活性檢測(cè)基于熒光猝滅法，對(duì)熒光猝滅機(jī)理進(jìn)行探討，并對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到反應(yīng)溶液最優(yōu)pH為9，量子點(diǎn)與過氧化氫最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為10 min。在最優(yōu)條件下，對(duì)過氧化氫酶活性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍為0.25～12.00? U/L，過氧化氫和酶反應(yīng)前后熒光差值（F1- Fn）與猝滅前熒光值（F0）的比與過氧化氫酶活性有較好的相關(guān)性（R2=0953）。酶量檢測(cè)基于競(jìng)爭(zhēng)免疫熒光法，通過對(duì)固化時(shí)間、抗體濃度等參數(shù)的優(yōu)化，獲得酶量檢測(cè)的最優(yōu)模型，檢測(cè)范圍為0.04～1.40 mg/L（R2=0.964）。通過簡(jiǎn)單的樣品前處理，對(duì)大米中的過氧化氫酶活性及酶量進(jìn)行檢測(cè)，得到酶活性檢測(cè)加標(biāo)回收率為92.0%～114.0%，酶量檢測(cè)加標(biāo)回收率為85.0%～115.0%。[結(jié)論]該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，通過一次簡(jiǎn)單的樣品前處理，獲得酶活性及酶量檢測(cè)的食品樣品提取液，為食品中過氧化氫酶活性及酶量的快速測(cè)定提供了一種新的思路。

關(guān)鍵詞 CdTe/CdS-GSH量子點(diǎn);熒光探針;過氧化氫酶活性;過氧化氫酶量;快速測(cè)定

中圖分類號(hào) TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）11-0194-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.11.056

Abstract [Objective] The research aimed to propose a method for detecting catalase activity and enzyme amount based on quantum dot fluorescent probe.[Method]CdTe/CdS quantum dots stabilized by glutathione （GSH） were used as fluorescent probes to quantitatively analyze catalase activity and enzyme amount.[Result]Catalase activity quantitatively determine based on fluorescent quenching effect of CdTe/CdSGSH QDs， parameters affecting the fluorescent response were optimized， the optimal pH of the reaction solution was 9， the optimal reaction time of QDs and H2O2 was 10 min. Under the optimum conditions， the determination of catalase was in the range from 0.25 U/L to 12.00 U/L. The difference value of fluorescence intensity after reaction of H2O2 and catalase was labeled as “Fn-F1”， the fluorescent value before quenching was labeled as “F0”， the ratio of “Fn-F1” and “F0” had a good relationship （R2=0. 953） with catalase activity. This developed method was applied to detect catalase activity in rice samples， the recovery ratio was 92.0%-114.0%.Catalase amount quantitatively determine based on fluoroimmunoassay method， under the optimum conditions， the fluorescence strength of QDs had a good relationship （R2=0.964） with concentration of catalase in the range from 0.04? mg/L to 1.40? mg/L， the recovery ratio was 85.0%-115.0%.[Conclusion] The method is simple， accurate and sensitive. The food sample extract obtained by enzyme preparation and enzyme amount detection by a simple sample preparation provides a new idea for the rapid determination of catalase activity and enzyme amount in food.

Key words CdTe/CdSGSH quantum dots;Fluorescence probe;Catalase activity;Catalase amount;Rapid determination

基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD041204）。

作者簡(jiǎn)介 翟晨（1988—），女，山東淄博人，工程師，博士，從事食品品質(zhì)與安全的快速檢測(cè)技術(shù)研究。*通信作者，高級(jí)工程師，博士，從事食品品質(zhì)與安全的檢測(cè)技術(shù)研究。

收稿日期 2018-11-18

過氧化氫酶是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，是生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶[1-2]。通過過氧化氫酶活性的預(yù)測(cè)可以早期預(yù)警儲(chǔ)藏玉米是否污染AFB1[3]、優(yōu)化糧食儲(chǔ)存條件[4-5]、監(jiān)測(cè)果蔬品質(zhì)劣變狀態(tài)[6]、檢測(cè)種子活性[7]等，因此準(zhǔn)確且靈敏地預(yù)測(cè)過氧化氫酶活性具有重要意義。但預(yù)測(cè)過氧化氫酶活性需要進(jìn)行酶提取，酶脫離生物組織，活性會(huì)發(fā)生一定的變化，因此結(jié)合酶量的檢測(cè)可更全面地說明生物組織內(nèi)過氧化氫酶的變化規(guī)律。

測(cè)定過氧化氫酶活性的常用方法有高錳酸鉀滴定法、碘量滴定法、分光光度法和氣量法等[8]，這些方法準(zhǔn)確度較高，但靈敏度較低，難以監(jiān)測(cè)到樣品中過氧化氫酶活性的微量變化，因此需要開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的過氧化氫酶活性檢測(cè)方法。過氧化氫酶含量的檢測(cè)常用方法有熒光PCR[9]、免疫印跡法[10]、考馬斯亮藍(lán)染色法[11]等，這些方法從基因或者蛋白層面分析酶量，但存在前處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、特異性差等缺點(diǎn)。因此需要開發(fā)一種準(zhǔn)確、靈敏，且通過一次簡(jiǎn)單的樣品前處理，能夠快速獲得酶活性及酶量的檢測(cè)方法。

量子點(diǎn)是一種“準(zhǔn)零維”的納米顆粒，具有吸收譜較寬、發(fā)光效率高以及穩(wěn)定性好等優(yōu)異的光學(xué)特性[12-13]。量子點(diǎn)的發(fā)光性能與其表面狀態(tài)密切相關(guān)，其熒光猝滅作用都是由量子點(diǎn)表面狀態(tài)的變化而引起的[14-15]。量子點(diǎn)作為新型熒光探針具有高靈敏度、快速、低檢測(cè)限的優(yōu)勢(shì)[16]，近幾年在小分子快速檢測(cè)方面應(yīng)用較多。筆者提出一種基于以谷胱甘肽穩(wěn)定的CdTe/CdS量子點(diǎn)（CdTe/CdS-GSH）為熒光探針的過氧化氫酶活性及酶量檢測(cè)方法，通過一次簡(jiǎn)單的樣品前處理，快速、靈敏地獲得樣品中的過氧化氫酶活性及酶量，為過氧化氫酶的精準(zhǔn)檢測(cè)提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Hitachi F-7000熒光分光光度計(jì);Hitachi U-3900分光光度計(jì);Sartorius PB-10型pH計(jì);Eppendorf 5415R小型高速冷凍離心機(jī)。

CdTe/CdS-GSH 量子點(diǎn)購(gòu)買于蘇州星爍納米科技有限公司;羧基化磁性納米球購(gòu)買于武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司;過氧化氫酶（2 000 U/mg）及過氧化氫酶抗體均購(gòu)買于上海士鋒生物科技有限公司;過氧化氫、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）等試劑均為分析純;試驗(yàn)中所用水為純水器Milli-Q reference處理的超純水。

1.2 過氧化氫酶活性檢測(cè)

在室溫下，用pH 7.4的PBS緩沖溶液制備一系列不同活性的過氧化氫酶溶液，與定量過氧化氫反應(yīng)10 min后，得到反應(yīng)液A。在一系列10 mL比色管中，分別加入500 μL CdTe/CdS-GSH 量子點(diǎn)溶液以及1 mL新鮮制備的反應(yīng)液A，用緩沖溶液定容至5 mL，充分搖勻后室溫下放置一段時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)。

將以上制備好的溶液潤(rùn)洗并倒入10 mL四面通透的比色皿中，在325 nm激發(fā)光激發(fā)下，測(cè)定并記錄586 nm處熒光強(qiáng)度F，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均是5 nm。

1.3 過氧化氫酶量檢測(cè)

1.3.1 過氧化氫酶抗體-磁性粒子復(fù)合物。25 mg/mL的磁性粒子中加入6 mg/mL EDC和4 mg/mL NHS PBS緩沖溶液（pH 6.0），室溫下振蕩反應(yīng)30 min，磁分離，PBS溶液洗滌3次后加入5 μL過氧化氫酶抗體（pH 7.4），在37 ℃下振蕩孵育2 h，磁分離，洗滌3次除去未結(jié)合的抗體，得到過氧化氫酶抗體-磁性粒子復(fù)合物。

1.3.2

過氧化氫酶-量子點(diǎn)復(fù)合物。取CdTe/CdS-GSH 量子點(diǎn)溶液150 μL，經(jīng)EDC和NHS室溫下活化15 min，加入過氧化氫酶溶液（pH 7.4），置于37 ℃搖床上2 h，加入10 g/L牛血清白蛋白（BSA）溶液以封閉量子點(diǎn)上未反應(yīng)的羧基位點(diǎn)，將偶聯(lián)反應(yīng)所得到的溶液放置于4 ℃過夜保存。

將已知濃度的過氧化氫酶溶液與10 μL過氧化氫酶抗體-磁性粒子復(fù)合物在37 ℃下振蕩反應(yīng)30 min，磁分離，用pH 7.4 PBS溶液洗滌3次后，用PBS溶液定容至1 mL，加入過氧化氫酶-量子點(diǎn)復(fù)合物，37 ℃下振蕩反應(yīng)30 min，磁分離，洗滌3次，去除多余的過氧化氫酶-量子點(diǎn)復(fù)合物，將該溶液進(jìn)行熒光掃描，在325 nm激發(fā)光激發(fā)下，測(cè)定并記錄586 nm處熒光強(qiáng)度F，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均是5 nm。

1.4 酶活性及酶量檢測(cè)原理

過氧化氫導(dǎo)致CdTe/CdS-GSH 量子點(diǎn)熒光猝滅，猝滅前（F0）后（Fn）的熒光比值（Fn/F0）與過氧化氫的濃度呈負(fù)相關(guān)。過氧化氫酶活性越強(qiáng)，底物過氧化氫被分解的越多，熒光猝滅程度越小，過氧化氫與酶反應(yīng)前（F1）后（Fn）的熒光差值與熒光猝滅前（F0）熒光值的比為[（Fn- F1）/ F0]，該值與過氧化氫酶活性建立數(shù)學(xué)關(guān)系。

通過酰胺反應(yīng)，分別制備過氧化氫酶抗體-磁性粒子復(fù)合物、過氧化氫酶-量子點(diǎn)復(fù)合物。樣品中的酶通過免疫反應(yīng)首先與過氧化氫酶抗體-磁性粒子結(jié)合，過氧化氫酶-量子點(diǎn)復(fù)合物再與過氧化氫酶抗體-磁性粒子復(fù)合物混合，使抗體中剩余的結(jié)合位點(diǎn)通過與過氧化氫酶將CdTe/CdS-GSH量子點(diǎn)結(jié)合到磁性粒子上，通過磁鐵吸附，除去未結(jié)合的量子點(diǎn)。通過量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，判斷抗體與樣品中酶反應(yīng)后剩余的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，進(jìn)而得到樣品中過氧化氫酶量。酶活性及酶量檢測(cè)原理如圖1所示。

1.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證該方法是否可以應(yīng)用于實(shí)際樣品中微量過氧化氫酶活性及含量的檢測(cè)，以大米為研究對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。將大米放置于烘箱中，在100 ℃環(huán)境下過夜，使樣品中的過氧化氫酶滅活。將加熱處理過的大米打碎并充分研磨，研磨后將大米分成均勻的小份，每小份添加不同量的過氧化氫酶（微量，樣品總質(zhì)量增加可忽略），在冰水浴下再次進(jìn)行充分研磨后將每份樣品加入5 mL pH 7.4 PBS緩沖溶液，充分搖勻，在0 ℃下6 000 r/min離心20 min，取上清液按照“1.2”及“1.3”方法進(jìn)行過氧化氫酶活性及酶量檢測(cè)[5，17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于量子點(diǎn)猝滅的酶活性檢測(cè)

2.1.1 猝滅機(jī)理探討。

采集過氧化氫猝滅量子點(diǎn)前后的熒光光譜，并進(jìn)行分析，從325 nm激發(fā)光激發(fā)下的波長(zhǎng)掃描光譜圖（圖2a）可看出，隨著過氧化氫濃度增大，熒光峰強(qiáng)度越來越小，且逐漸藍(lán)移，當(dāng)熒光強(qiáng)度降至原來的50%時(shí)，波長(zhǎng)藍(lán)移約8 nm。推測(cè)原因是過氧化氫具有強(qiáng)氧化性，能夠氧化量子點(diǎn)導(dǎo)致表面產(chǎn)生新的缺陷，量子點(diǎn)的有效尺寸減少，且增加了非輻射方式的電子躍遷，減少了量子點(diǎn)本身的電子-空穴直接復(fù)合，即減小了激子態(tài)熒光的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致熒光猝滅[18-19]。從量子點(diǎn)與過氧化氫反應(yīng)前后的紫外-可見吸收光譜（圖2b）可以看出，CdTe/CdS-GSH 量子點(diǎn)的吸收峰在538 nm處，過氧化氫在350～650 nm處無明顯吸收峰，過氧化氫與量子點(diǎn)反應(yīng)后，吸收峰藍(lán)移且峰值逐漸降低，當(dāng)過氧化氫濃度較高時(shí)，該吸收峰基本消失，這是由于量子點(diǎn)表面缺陷導(dǎo)致熒光物質(zhì)吸收光譜發(fā)生改變。從圖2a中插圖的熒光猝滅的Stern-Volmer曲線可以看出，F(xiàn)0/F值隨著過氧化氫濃度增大而逐漸增大，但是該增長(zhǎng)曲線非直線，說明量子點(diǎn)的熒光猝滅是通過復(fù)雜的多元作用實(shí)現(xiàn)的[20]。

2.1.2 檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化。

反應(yīng)溶液pH、量子點(diǎn)與過氧化氫反應(yīng)時(shí)間等條件影響方法的靈敏度。如圖3a所示，量子點(diǎn)猝滅前，在酸性環(huán)境下熒光值較低，隨著pH增加熒光值逐漸增高，在pH為9.0左右時(shí)熒光值最高。量子點(diǎn)與一定濃度的過氧化氫溶液反應(yīng)后，相比猝滅前，熒光強(qiáng)度有明顯下降，由圖3a可見，當(dāng)pH為9.0時(shí)該比值最小，即該pH時(shí)，量子點(diǎn)由過氧化氫的氧化而造成的猝滅最敏感，進(jìn)而對(duì)過氧化氫的濃度變化也最靈敏，綜上所述，試驗(yàn)的緩沖溶液選取pH為9.0的磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩沖溶液。

過氧化氫氧化量子點(diǎn)，導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光猝滅，該氧化時(shí)間是否影響猝滅效果需要進(jìn)行探討，從圖3b可看出，量子點(diǎn)與不同濃度的過氧化氫（Ⅰ，濃度較低;Ⅱ，濃度較高）反應(yīng)，熒光值均迅速下降，過氧化氫濃度較高時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)下降幅度較大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過10 min后，無論過氧化氫濃度高低，量子點(diǎn)熒光值基本恒定，該現(xiàn)象可能是過氧化氫氧化量子點(diǎn)達(dá)到飽和導(dǎo)致，因此量子點(diǎn)與過氧化氫的最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.1.3 預(yù)測(cè)模型建立。

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，過氧化氫的加入使量子點(diǎn)熒光猝滅，當(dāng)量子點(diǎn)與不同濃度的過氧化氫反應(yīng)，猝滅值也有較大的差異。過氧化氫在過氧化氫酶的催化下，快速分解為水和氧氣，相同時(shí)間下，過氧化氫溶液分別與不同活性的過氧化氫酶混合后，活性較高的酶催化分解的過氧化氫分子相對(duì)較多，將該混合溶液與量子點(diǎn)溶液反應(yīng)，由于導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光猝滅的過氧化氫分子較少，因此熒光的猝滅程度較低，反之，熒光的猝滅程度較高，如圖4所示，酶活性在0.25～12.00 U/L，隨著活性的增加，猝滅后的熒光值（Fn）越高，將過氧化氫與酶反應(yīng)前（F1）后（Fn）的熒光值與熒光猝滅前（F0）的熒光值的比[（Fn - F1）/F0]與過氧化氫酶的活性進(jìn)行相關(guān)性分析，得到?jīng)Q定系數(shù)R2為0.953（圖5），說明可以采用該方法對(duì)過氧化氫酶活性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確且靈敏的預(yù)測(cè)。

2.2 基于量子點(diǎn)免疫熒光的酶量檢測(cè)

2.2.1 檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化。

制備過氧化氫酶抗體-磁性粒子復(fù)合物時(shí)，抗體與磁珠的固化時(shí)間影響所制備的復(fù)合物數(shù)量，導(dǎo)致可結(jié)合的酶量相應(yīng)減少，進(jìn)而影響檢測(cè)效果。固化時(shí)間分別設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，隨著固化時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)固化時(shí)間大于2 h時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，因此過氧化氫酶抗體與磁性粒子的最優(yōu)固化時(shí)間為2 h。抗體的濃度也對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要的影響，抗體過少導(dǎo)致該復(fù)合物制備數(shù)量減少，過多導(dǎo)致抗體浪費(fèi)，經(jīng)優(yōu)化，抗體的濃度為125 μg/mL。

制備過氧化氫酶-量子點(diǎn)復(fù)合物時(shí)，緩沖溶液濃度、過氧化氫酶濃度及反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)關(guān)系該復(fù)合物制備效果，對(duì)以

上試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)條件如下：緩沖溶液濃度為1 mmol/L，添加過氧化氫酶量為20 μL，反應(yīng)時(shí)間為2 h。

2.2.2 模型建立。

樣品中的過氧化氫酶較多時(shí)，導(dǎo)致帶有量子點(diǎn)的過氧化氫酶較少地與磁性粒子結(jié)合，熒光強(qiáng)度較弱，因此過氧化氫酶量與熒光強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，如圖6a所示，隨著過氧化氫酶量的增加，熒光強(qiáng)度逐漸下降，由于磁納米粒子的影響，熒光光譜基線漂移，導(dǎo)致直接定量困難，因此對(duì)光譜進(jìn)行基線校準(zhǔn)，校準(zhǔn)結(jié)果見圖6b，采用自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘法（adaptive iteratively reweighted Penalized Least Squares，airPLS），可在保留有用光譜信息的基礎(chǔ)上，對(duì)基線進(jìn)行準(zhǔn)確校準(zhǔn)。對(duì)校準(zhǔn)后的熒光光譜進(jìn)行定量分析，隨著酶量增加，熒光峰值逐漸下降，在0.04～1.40 mg/L酶量與熒光峰值呈線性關(guān)系，如圖7建立預(yù)測(cè)模型，酶量與峰值具有較好的相關(guān)性（R2=0.964）。此結(jié)果說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

將滅活的大米打磨后分成均勻小份，分別加入不同量的過氧化氫酶，按照該研究開發(fā)的試驗(yàn)方法測(cè)得酶活性及酶量，結(jié)果見表1～2，酶活性檢測(cè)加標(biāo)回收率為92.0%～114.0%，酶量檢測(cè)加標(biāo)回收率為85.0%～115.0%，說明該方法檢測(cè)實(shí)際樣品具有可行性。

3 結(jié)論

該研究以谷胱甘肽（GSH）穩(wěn)定的CdTe/CdS量子點(diǎn)為熒光探針，對(duì)過氧化氫酶活性及酶量進(jìn)行定量分析，在最優(yōu)條件下，基于熒光猝滅機(jī)理建立了酶活為0.25～12.00 U/L的預(yù)測(cè)操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，通過一次簡(jiǎn)單的樣品前處理，得到酶活性及酶量檢測(cè)的樣品提取液，為食品中過氧化氫酶活性及酶量的快速、靈敏測(cè)定提供了一種新的思路。