RP-HPLC法測定隴南9個品種花椒麻味物質(zhì)的含量

朱建朝,周婭瓊,馬君義,*,尚賢毅,王惠明,曹永紅

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.隴南市經(jīng)濟林研究院花椒研究所,甘肅隴南 746000)

食藥兩用的花椒是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL)植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)或青椒(Z.schinifoliunSieb.et Zucc)的干燥成熟果皮,具有濃郁的辛香味和淳樸的麻味,不但可以作為調(diào)味品,而且藥用價值較高,可溫中止疼、殺蟲止癢,用于脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、蟲積腹痛,能夠抑制iNOS、mRNA活性[1-4]?；ń仿槲段镔|(zhì)是一類以山椒素[5-7]為代表的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺,是花椒特有的辛麻味成分,也是花椒品質(zhì)鑒定的重要指標(biāo)之一,具有麻醉、興奮、抑菌、祛風(fēng)除濕、殺蟲和鎮(zhèn)痛等功效[8]。

有關(guān)花椒麻味物質(zhì)含量測定分析的方法主要有紫外-可見分光光度計法[9]、甲醛滴定法[10]、高效液相色譜(HPLC)法[11-12]等,前兩種測定方法操作簡單,成本低廉,但準(zhǔn)確度較低,誤差較大,而HPLC法測定花椒麻味物質(zhì)的含量結(jié)果精確可靠。隴南是我國花椒主要生產(chǎn)區(qū)之一,其種質(zhì)資源豐富[13],栽培歷史悠久,品質(zhì)好,早在唐朝時期就被列為貢品。國內(nèi)學(xué)者對隴南花椒的研究主要集中在豐產(chǎn)栽培、品種選育、無性快繁[14-15]等方面,有關(guān)其風(fēng)味物質(zhì)成分與含量的系統(tǒng)研究鮮有報道,致使隴南花椒資源開發(fā)與利用進程緩慢。本研究利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定了隴南9個栽培品種花椒麻味物質(zhì)的含量,并初步探討了花椒麻味物質(zhì)的含量與品種關(guān)系,以期為花椒品種培育以及食品工業(yè)或食品行業(yè)原料選擇提供參考,為隴南花椒品質(zhì)評價和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

9個栽培品種花椒 均采自隴南市經(jīng)濟林研究院花椒研究所種質(zhì)資源基因庫，花椒名稱、品種引進地以及特征如表1所示,花椒種質(zhì)資源基因庫設(shè)在隴南市武都區(qū)馬街鎮(zhèn)沙坪片,海拔1410 m,屬北亞熱帶向暖溫帶過渡溝谷半干旱氣候,年平均氣溫13.9 ℃,年降水量413 mm,年蒸發(fā)量1948 mm,相對濕度61%,全年日照時數(shù)1533 h,太陽年總輻射2013.9 Mj·m-2,無霜期平均為260 d,土壤為山地棕壤,自然含水率3.5%,pH7.32；花椒麻味物質(zhì)對照品貯備液(100 μg·mL-1) 由西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院闞建全教授提供;甲醇 分析純、色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠;實驗用水 超純水。

表1 花椒品種信息

FLB-500A型萬能高速粉碎機 上海菲力博食品機械有限公司;DHb-914385-11型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SHZ-A型恒溫振蕩器 金壇市城西春蘭實驗儀器廠;UltiMate 3000型高效液相色譜儀 美國戴安公司;UPT-I-20T型優(yōu)普超純水機 西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品的制備 將花椒果皮置于培養(yǎng)皿內(nèi),在50 ℃下干燥5 min,冷卻后粉碎成粉末,不過篩,精密稱取約1.000 g于250 mL具塞錐形瓶中,加入50 mL甲醇,封口,50 ℃水浴振蕩提取12 h,0.45 μm有機相微孔濾膜抽濾,濾渣再用30 mL甲醇重復(fù)提取3 h,合并濾液并定容于100 mL容量瓶中[16]。濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾頭過濾后,冷藏(-2 ℃)待測。

1.2.2 RP-HPLC分析條件 色譜分析條件參照DB50/T 321-2009《花椒麻味物質(zhì)的檢測方法 高效液相色譜法》[16],稍有改動。用十八烷基鍵合硅膠為固定相,Diamonsil Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),甲醇∶水(V∶V=60∶40)為流動相,流速1 mL·min-1,柱溫35 ℃,檢測波長為254 nm,進樣量20 μL,分離度等色譜參數(shù)通過色譜工作站獲得。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取100 μg·mL-1的花椒痳味物質(zhì)對照品貯備液,用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為:0、3.125、6.25、12.5、25、50、75 μg·mL-1的系列對照品溶液,按1.2.2項下色譜條件依次進樣,并測定花椒麻味物質(zhì)對照品溶液的響應(yīng)值(3個峰的峰面積總和),樣品平行測定3次,以花椒痳味物質(zhì)質(zhì)量濃度對峰面積(3個峰的峰面積總和)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度試驗 精密吸取25 μg·mL-1的花椒麻味物質(zhì)對照品溶液,按1.2.2項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次,記錄峰面積,計算RSD。

1.2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取干燥粉碎的郭嘉大紅袍花椒粉末6份,每份約1.000 g,按照1.2.1項下供試品溶液的制備方法提取花椒麻味物質(zhì),再按1.2.2項下色譜條件分別進樣,每個樣品平行進樣3次,記錄峰面積,計算RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取干燥粉碎的郭嘉大紅袍花椒粉末約1.000 g,按照1.2.1項下供試品溶液的制備方法提取花椒麻味物質(zhì),再按1.2.2項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣,記錄峰面積,計算RSD。

1.2.7 加標(biāo)回收率試驗 精密吸取1.2.6制備的已知含量的郭嘉大紅袍供試品溶液1 mL于9支Eppendorf管中,依次加入100 μg·mL-1花椒痳味物質(zhì)對照品溶液50、50、50、100、100、100、150、150、150 μL,再按1.2.2項下色譜條件分別進樣,每個樣品平行進樣3次,記錄峰面積,計算回收率和RSD。

1.2.8 檢出限與定量限 精密吸取花椒麻味物質(zhì)對照品溶液,用甲醇逐級稀釋定容成一系列的溶液。以信噪比為3∶1時的質(zhì)量作為檢出限,信噪比為10∶1時的質(zhì)量作為定量限。

1.2.9 供試品含量的測定 取20 μL隴南9個栽培品種花椒麻味物質(zhì)供試品溶液,采用高效液相色譜儀,按1.2.2項下色譜條件依次進樣,并測定花椒麻味物質(zhì)對照品溶液的響應(yīng)值(3個峰的峰面積總和),每樣平行測定3次,利用回歸方程計算各供試品中麻味物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 反相高效液相色譜分析條件的考察

反相高效液相色譜檢測花椒麻味物質(zhì)對照品溶液,其色譜圖如圖1所示。由圖1可知,花椒麻味物質(zhì)在18、20、22 min左右出峰,1號峰與2號峰分離度為2.8,2號峰和3號峰分離度為3.3,峰無分叉,無拖尾,并且與芮光偉等[17]高效液相色譜(HPLC)法測定花椒麻味物質(zhì)色譜圖一致,說明反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定花椒麻味物質(zhì)的含量條件合適,且分離效果好。

圖1 花椒麻味物質(zhì)對照品RP-HPLC色譜圖

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系的考察 以花椒痳味物質(zhì)質(zhì)量濃度(Y)對3個峰面積之和(X)作圖,得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),其回歸方程為Y=1.0596X-0.3939,相關(guān)系數(shù)r=0.9998(n=6),花椒痳味物質(zhì)質(zhì)量濃度在3.125～75 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 精密度試驗 精密度試驗結(jié)果如表2所示,由表2可知,連續(xù)6次測定峰面積的RSD為1.26%,說明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.2.3 重復(fù)性試驗 重復(fù)性試驗結(jié)果如表3所示。由表3可知,6份樣品進樣峰面積的RSD為1.43%,說明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 由表4可知,穩(wěn)定性試驗6次進樣峰面積的RSD為1.30%,說明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2.5 加標(biāo)回收率試驗 由表5可知,加標(biāo)回收率范圍在96.60%～101.70%,RSD為1.67%,說明該方法準(zhǔn)確性良好。

表5 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

2.2.6 檢測限和定量限 花椒麻味物質(zhì)檢測限和定量限分別為0.3、0.5 μg·mL-1,按進樣量為20 μL換算,則該方法的檢測限為6.00 ng,定量限為10.00 ng。

綜合分析表2～表5,檢測方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性,加標(biāo)回收率的RSD均小于1.7%,檢出限為6.00 ng,定量限為10.00 ng。說明RP-HPLC檢測花椒麻味物質(zhì)的含量方法合理可行。

2.3 供試品含量的測定

隴南9個栽培品種花椒麻味物質(zhì)的RP-HPLC色譜圖如圖3所示,其花椒麻味物質(zhì)的含量見表6。

圖3 隴南9個栽培品種花椒麻味物質(zhì)RP-HPLC色譜圖

表6 隴南9個栽培品種花椒麻味物質(zhì)的含量

由表6可知,林州大紅袍的麻味物質(zhì)含量最高,為(121.68±3.33) mg·g-1,其次為漢源青椒(110.03±2.67) mg·g-1、大紅袍(96.14±1.58) mg·g-1、茂汶大紅袍(87.53±0.53) mg·g-1、七月椒(51.70±1.78) mg·g-1、梅花椒(49.63±1.19) mg·g-1、獅子頭(44.92±1.24) mg·g-1,韓城無刺(43.49±1.86) mg·g-1,麻味物質(zhì)含量最低的為郭嘉大紅袍(26.38±0.91) mg·g-1,本實驗結(jié)果與王玉奇等[18]、付陳梅等[19]的研究結(jié)果相近,并且麻味物質(zhì)含量高于闞建全等[20]研究全國141份花椒麻味物質(zhì)的含量,說明隴南花椒的麻味物質(zhì)含量較高。從整體分析,隴南9個品種花椒麻味物質(zhì)的含量存在品種間差異,除梅花椒與七月椒、獅子頭與韓城無刺麻味物質(zhì)的含量無顯著性差異外(p>0.05),其余品種麻味物質(zhì)的含量均存在顯著性差異(p<0.05),9個品種花椒麻味物質(zhì)的含量差異百分比在(3.34±1.67)%～(78.32±0.15)%之間。由于隴南9個栽培品種花椒在生長過程中,土壤肥力、水分以及光照等栽培管理條件相同,因此,花椒麻味物質(zhì)的含量差異可能是由于花椒品種遺傳背景不同,在成熟期內(nèi),麻味物質(zhì)的成分以及含量的增長率不同導(dǎo)致的[21]。

3 結(jié)論

麻味物質(zhì)含量是花椒品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一。本分析檢測的花椒痳味物質(zhì)線性范圍3.125～75 μg·mL-1,相關(guān)系數(shù)r=0.9998,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率的RSD均小于1.7%,花椒麻味物質(zhì)的檢出限為6.00 ng,定量限為10.00 ng,符合方法學(xué)考察要求。隴南9個栽培品種花椒麻味物質(zhì)的含量較高,尤其是林州大紅袍(121.68±3.33 mg·g-1),漢源青椒(110.03±2.67 mg·g-1)、大紅袍(96.14±1.58 mg·g-1)、茂汶大紅袍(87.53±0.53 mg·g-1)。隴南9個品種花椒麻味物質(zhì)的含量存在品種間差異,其含量差異百分比在(3.34±1.67)%～(78.32±0.15)%之間,這種差異可能是與花椒品種遺傳背景不同、成熟過程中麻味物質(zhì)的成分及含量的增長率不同有關(guān)。本研究結(jié)果為花椒優(yōu)質(zhì)品種的篩選提供了參考,為隴南花椒品質(zhì)評價和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。