靈芝三萜酸改善小鼠睡眠作用研究

俞 盈,吳學(xué)謙,熊科輝,包國良,許海順,徐 娟,吳慶其,李青青,么春艷

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,保健食品研究所,浙江杭州 310013)

睡眠是人類和高等動物必須的生理過程,是維持體力和健康的基礎(chǔ)。失眠是一種常見的睡眠障礙,指不能入睡或不能維持睡眠狀態(tài)[1]。慢性失眠的發(fā)病率大概為15%[2],短暫性失眠的發(fā)病率約為80%[3]。目前對于失眠的治療以服用人工合成藥物為主,然而合成藥物存在嚴(yán)重的藥物依賴、認(rèn)知和運(yùn)動損害、停藥反跳性失眠等不良反應(yīng)。因此,亟需尋找發(fā)展安全有效的鎮(zhèn)靜安神藥物,以突破鎮(zhèn)靜安神藥物和飲食補(bǔ)充劑的發(fā)展瓶頸。

靈芝為多孔菌科赤芝[Ganodermalucidum(Leyss. ex. Fr.)Karst.]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子實(shí)體,自古就有“仙草”、“瑞草”之稱,藥用價值極高,是我國珍貴的菌藻類藥材。我國人民把它作為藥用已有2000多年的歷史,周朝古籍《列子》一書中就有“朽壤之上,有菌者芝”。靈芝的“安神”作用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,2005年版《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》和2010年版《中華人民共和國藥典》均記述了靈芝具有“益氣安神”作用。

在靈芝的多種活性成分中,水溶性的靈芝多糖和醇溶性的三萜類化合物是主要生物活性成分,其含量高低是衡量靈芝藥用價值和品質(zhì)的重要指標(biāo)。靈芝多糖一直作為靈芝的主要有效成分,關(guān)于靈芝多糖改善睡眠的動物實(shí)驗(yàn)研究較多[4-9],也有一些科學(xué)研究涉及作用機(jī)制及人體試食[10-11],但研究結(jié)果并不一致。近年來,靈芝三萜酸作為靈芝的特有成分而備受關(guān)注。國內(nèi)外關(guān)于靈芝三萜酸的研究以優(yōu)化其提取工藝及含量檢測居多[12],運(yùn)用現(xiàn)代藥理方法研究靈芝三萜酸鎮(zhèn)靜安神作用的研究報道并不多見。Cho等[13]應(yīng)用放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn),體外實(shí)驗(yàn)證明靈芝子實(shí)體醇提物γ-氨基丁酸A(GABAA)受體有中等強(qiáng)度親和力,其可能通過GABAA受體改善睡眠,但并未進(jìn)一步在動物體內(nèi)驗(yàn)證其藥理作用。賈薇等[4]研究發(fā)現(xiàn)靈芝三萜與茯苓提取物有協(xié)同改善睡眠的功能,但作用機(jī)制不明確。其他相關(guān)研究未見報道,因此,本實(shí)驗(yàn)研究通過直接睡眠實(shí)驗(yàn)、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)研究了靈芝三萜酸的鎮(zhèn)靜安神作用,為靈芝子實(shí)體相關(guān)的食品及保健食品研發(fā)提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠,清潔級健康,體重18～22 g,雄性,50只,浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)證許可證號SCXK(浙)2014-0001;赤靈芝子實(shí)體 由浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司提供,產(chǎn)地為浙江五養(yǎng)堂原木靈芝栽培基地,于每年10月進(jìn)行采摘,65 ℃烘箱干燥12 h,粉碎,過 60目篩備用;95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、NaOH、HCl、冰乙酸、高氯酸、香草醛、吐溫80 均為分析純;齊墩果酸 純度≥98%,中國食品藥品檢定研究院;地西泮(Diazepam) Aladdin公司;戊巴比妥鈉、巴比妥鈉 Merck公司。

UV-3802型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;FB224電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝三萜酸的制備及測定 靈芝粗三萜酸的制備及精制參考文獻(xiàn)[14],略有修改:赤芝子實(shí)體精粉(過60目篩)100 g,95%乙醇20倍量超聲提取2次,超聲頻率40 kHz,每次30 min,合并提取液,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。所得浸膏重溶于水,用石油醚除脂,乙酸乙酯萃取3次,所得乙酸乙酯部分旋蒸干燥。將旋蒸干燥的乙酸乙酯部分重溶于乙酸乙酯,堿化至pH9～10,水洗至中性,將萃取得到的堿化水層酸化至pH2～3,用乙酸乙酯萃取3次得到粗靈芝三萜酸部分,將靈芝三萜酸部分旋蒸干燥即為含量測定及實(shí)驗(yàn)動物灌胃用樣品。

靈芝三萜酸含量的測定方法參見文獻(xiàn)[15],略作修改:靈芝三萜酸樣品0.24 g置于容量瓶中,加入乙酸乙酯溶解,超聲振動溶解,過濾定容至50 mL,用香草醛-高氯酸顯色反應(yīng)測定靈芝三萜酸的含量。樣品于548 nm處測定吸收值,以吸光值為縱坐標(biāo),以齊墩果酸含量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程,并計算受試物靈芝三萜酸的含量。

1.2.2 小鼠體重測定實(shí)驗(yàn) ICR小鼠飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房,溫度為22～25 ℃,相對濕度為40%～70%,光照-黑暗循環(huán)為12 h∶12 h,自由飲水?dāng)z食。動物實(shí)驗(yàn)通過本單位實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)開始前,稱量實(shí)驗(yàn)小鼠初始體重,并根據(jù)小鼠體重分為5組,分別是溶劑對照組(5% 吐溫80,10 mL/kg·bw)、陽性對照組(地西泮,2.5 mg/kg·bw)、靈芝三萜酸低劑量組(25 mg/kg·bw)、中劑量組(50 mg/kg·bw)、高劑量組(100 mg/kg·bw),每組10只。各組動物每天灌胃1次,連續(xù)灌胃30 d,每周于灌胃結(jié)束后稱取小鼠體重1次。

1.2.3 直接睡眠實(shí)驗(yàn) 各組動物每天分別給予相應(yīng)的受試物,觀察灌胃后30 min內(nèi),小鼠是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象,以動物的翻正反射消失超過60 s判為進(jìn)入睡眠,翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒[16]。比較溶劑對照組、靈芝三萜酸各劑量組對小鼠直接催眠的影響。

1.2.4 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn) 在戊巴比妥鈉催眠的基礎(chǔ)上,觀察各受試物是否延長睡眠時間,若睡眠時間延長,則說明受試物與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用[16]。各組小鼠每天給予靈芝三萜酸1次,連續(xù)30 d,于末次給予前12 h禁食不禁水。末次灌胃60 min后,各組小鼠給予48 mg/kg·bw戊巴比妥鈉(i.p.),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠的翻正反射消失60 s以上作為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn),以動物注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失的時間作為睡眠潛伏期,動物翻正反射消失到恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間,比較各受試物能否縮短戊巴比妥鈉注射小鼠的入睡潛伏期,延長睡眠時間。

1.2.5 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 各組小鼠每天給予靈芝三萜酸1次,連續(xù)30 d,于末次給藥予12 h禁食不禁水。在末次灌胃60 min后,各組動物(i.p.)給予32 mg/kg·bw戊巴比妥鈉,注射量為0.1 mL/10 g·bw,以小鼠的翻正反射消失達(dá)60 s以上作為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn),記錄30 min內(nèi)各組入睡動物數(shù)并計算睡眠發(fā)生率。睡眠發(fā)生率(%)=(入睡動物數(shù)/每組動物數(shù))×100[14]。

1.2.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 在巴比妥鈉催眠的基礎(chǔ)上,觀察受試物是否能夠縮短動物的入睡潛伏期,若潛伏期縮短,則說明受試物與巴比妥鈉有協(xié)同作用[16]。各組小鼠每天給予靈芝三萜酸1次,連續(xù)30 d,于末次給藥予12 h禁食不禁水。各劑量組在末次灌胃60 min后,各組動物按280 mg/kg·bw給予巴比妥鈉(i.p.),注射量為0.1 mL/10 g·bw,以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡指標(biāo),從注射巴比妥鈉到動物入睡即為睡眠潛伏期,觀察各組受試物能否縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝三萜酸的含量

靈芝三萜酸經(jīng)過提取及初步精制,去除脂肪酸等小極性化合物產(chǎn)生的干擾,以吸光值為縱坐標(biāo),以齊墩果酸含量為橫坐標(biāo),得到回歸方程y=9.7202x+0.0033,r=0.9997。根據(jù)回歸方程計算得出受試物靈芝三萜酸的含量為11.49%。

2.2 靈芝三萜酸對小鼠體重的影響

靈芝三萜酸25、50、100 mg/kg劑量組的實(shí)驗(yàn)小鼠初始體重與溶劑對照組(吐溫80)和陽性對照組(地西泮)比較差異均不顯著(p>0.05)(表1),連續(xù)灌胃給予受試物30 d后,靈芝三萜酸各劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠體重與溶劑對照組和陽性對照組均沒有顯著性差異(p>0.05)(表1),表明靈芝三萜酸對小鼠體重?zé)o明顯影響,在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計劑量下對小鼠體重未顯示出明顯的不良作用。

表1 靈芝三萜酸對小鼠體重的影響(n=10)Table 1 Effect of triterpene acids of G. lucidum on body weight of mice(n=10)

2.3 靈芝三萜酸對直接睡眠的影響

各組小鼠在給予受試物60 min內(nèi),通過實(shí)驗(yàn)觀察,靈芝三萜酸組和溶劑對照組均未有直接睡眠現(xiàn)象發(fā)生,即靈芝三萜酸及對照溶劑對小鼠均無直接催眠作用,推測其與其他藥物協(xié)同使用產(chǎn)生的中樞鎮(zhèn)靜作用可能是其改善小鼠睡眠的主要作用機(jī)制。

2.4 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間的影響

按照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》對靈芝三萜酸進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn),研究其對小鼠睡眠時間的影響。在戊巴比妥鈉催眠的基礎(chǔ)上,若睡眠時間延長,則說明受試物與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用[16]。結(jié)果見圖1A,陽性對照組小鼠的睡眠潛伏期(237.08±14.37) s極顯著低于溶劑對照組(297.14±22.62) s(p<0.01),靈芝三萜酸低、中、高劑量組小鼠睡眠潛伏期隨劑量縮短,分別為(260.87±16.67)、(250.24±55.57)、(252.73±36.43) s;靈芝三萜酸50和100 mg/kg組與溶劑對照相比均差異顯著(p<0.05),而靈芝三萜酸25 mg/kg組與溶劑對照組相比,其睡眠潛伏期降低12.21%,但不具有顯著性差異(p>0.05)。說明靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉具有協(xié)同作用,50和100 mg/kg劑量與一定劑量戊巴比妥鈉聯(lián)合作用能夠縮短小鼠的入睡時間。

實(shí)驗(yàn)小鼠的睡眠時間結(jié)果見圖1B,靈芝三萜酸25、50、100 mg/kg劑量組的睡眠時間為(2474.86±755.91)、(2941.43±587.57)、(3541.25±500.67) s,與溶劑對照組(1554.14±395.64) s比較,靈芝三萜酸各劑量組小鼠睡眠時間分別延長59.24%、89.26%、127.86%,均具有極顯著差異(p<0.01),且隨著劑量增加睡眠時間增長。陽性對照組地西泮的睡眠時間為(3346.67±537.96) s,睡眠時間延長115.34%,與溶劑對照組相比差異極顯著(p<0.01)。靈芝三萜酸高劑量組100 mg/kg的睡眠時間強(qiáng)于陽性對照組。說明一定劑量的靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用,可以極顯著(p<0.01)縮短小鼠的睡眠潛伏期并延長小鼠睡眠時間。

圖1 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間的影響(n=10)Fig.1 Effect of G. lucidum triterpene acids on pentobarbital-induced mice(n=10)注:A:靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉致睡眠小鼠睡眠潛伏期的影響;B:靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉致睡眠小鼠睡眠時間的影響;*:與溶劑對照組比較差異顯著,p<0.05;**:與溶劑對照組比較差異極顯著,p<0.01；圖2、表2同。

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)未見單獨(dú)對靈芝三萜酸進(jìn)行睡眠作用研究的相關(guān)報道。在靈芝水提物方面,Chu等[5]報道40 mg/kg的靈芝水提物與戊巴比妥鈉協(xié)同后,與空白對照組相比,未能顯著延長大鼠睡眠時間;80和120 mg/kg劑量的靈芝水提物與對照組相比,睡眠時間延長了50%和60%左右。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示,與空白對照組相比,靈芝三萜酸50和100 mg/kg的睡眠時間分別延長89.26%和127.86%?；具@一對比數(shù)據(jù),靈芝三萜酸改善睡眠的作用效果優(yōu)于靈芝水提物。

2.5 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)的影響

對靈芝三萜酸進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn),研究其對小鼠睡眠發(fā)生率的影響。由于戊巴比妥鈉通過肝酶代謝,而對該酶有抑制作用的藥物,也能延長戊巴比妥鈉睡眠時間。為了排除這種影響,降低戊巴比妥鈉的劑量,進(jìn)行閾下催眠實(shí)驗(yàn)[16]。結(jié)果見表2。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,靈芝三萜酸低、中、高劑量組的睡眠發(fā)生率分別為30%、50%、80%,均高于溶劑對照組的睡眠發(fā)生率(20%),且隨著受試物劑量的增加,睡眠發(fā)生率逐漸增加;靈芝三萜酸高劑量組100 mg/kg的睡眠發(fā)生率(80%)高于陽性藥物地西泮(60%)。與溶劑對照組相比,靈芝三萜酸25、50 mg/kg、地西泮組的睡眠發(fā)生率增加卻不具有顯著性差異(p>0.05),靈芝三萜酸100 mg/kg組與溶劑對照組相比顯著差異(p<0.05)。以上結(jié)果表明,靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉的協(xié)同睡眠作用并非通過影響戊巴比妥鈉的代謝過程而實(shí)現(xiàn)的。同時,其與戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似,在戊巴比妥鈉閾下催眠劑量睡眠實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)靈芝三萜酸100 mg/kg·bw的促睡眠效果強(qiáng)于陽性對照地西泮2.5 mg/kg。

表2 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉閾下劑量 睡眠發(fā)生率的影響(n=10)Table 2 Effect on sleeping rate of G. lucidum triterpene acids on the subthreshold of pentobarbital sodium in mice(n=10)

2.6 靈芝三萜酸對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

按照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》[16]對靈芝三萜酸進(jìn)行巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn),研究其對小鼠入睡時間的影響,結(jié)果見圖2。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出,在巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)中,靈芝三萜酸25、50、100 mg/kg的睡眠潛伏期分別為(1712.74±177.35)、(1632.00±301.95)、(1091.58±162.44) s,與溶劑對照組(2158.09±205.49) s比較,均能極顯著縮短小鼠睡眠潛伏期(p<0.01),表明靈芝三萜酸促進(jìn)小鼠入睡作用良好,且隨三萜酸劑量的增加,其促進(jìn)睡眠效果呈增強(qiáng)趨勢;靈芝三萜酸高劑量組100 mg/kg促進(jìn)睡眠作用(1091.58±162.44) s,強(qiáng)于地西泮2.5 mg/kg催眠作用(1212.84±107.54) s。因此,靈芝三萜酸低、中、高劑量組均能極顯著(p<0.01)縮短小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期,與巴比妥鈉協(xié)同促進(jìn)睡眠效果更明顯。

圖2 靈芝三萜酸對巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)的影響(n=10)Fig.2 Effect of G. lucidum triterpene acids on barbital sodium sleep incubation period test in mice(n=10)

從戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)及巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉、巴比妥鈉均具有較好的協(xié)同作用,既能促進(jìn)睡眠的發(fā)生,也有助于睡眠的維持。而靈芝三萜酸對睡眠的調(diào)節(jié)作用機(jī)制由經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、非典型性神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、激素或肽類中的一種或多種機(jī)制共同參與則有待于進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究通過直接睡眠實(shí)驗(yàn)、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)研究了自制靈芝三萜酸的改善睡眠作用。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》[16],延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)中,兩個實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)陽性,即可判定受試物具有改善睡眠的效果。本研究顯示,靈芝三萜酸延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果均呈現(xiàn)陽性,且100 mg/kg劑量組在三個實(shí)驗(yàn)中的促睡眠效果強(qiáng)于陽性對照地西泮(2.5 mg/kg),說明靈芝三萜酸具有很好的改善睡眠的作用。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究通過對靈芝三萜酸促進(jìn)睡眠的研究,確定靈芝三萜酸具有明顯的改善睡眠作用,關(guān)于靈芝三萜酸改善睡眠作用的作用機(jī)制本課題組將進(jìn)一步研究。