小鼠核糖核酸酶抑制劑異源高效可溶性表達(dá)、純化及活性研究

付大偉,孫瑩瑩,徐 偉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

核糖核酸酶抑制劑(Ribonuclease Inhibitor,RI)是一種能夠調(diào)節(jié)核糖核酸酶活性的酸性胞漿蛋白[1],廣泛應(yīng)用于涉及RNA的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。它與核糖核酸酶(RNase)以1∶1的比例結(jié)合抑制RNase活性[1]。它是一個(gè)在任何應(yīng)用中對付潛在RNase污染的十分有效的試劑。

目前,雖然市面上有較多商品化的RI出現(xiàn),但是價(jià)格較為昂貴。以大腸桿菌為宿主的重組蛋白原核表達(dá)方法由于成本降低而被廣泛使用[1]。但是,重組RI的表達(dá)很難在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中以可溶性的形式大量存在[2]。因此提高目的蛋白可溶性表達(dá)極為重要。

本研究旨在獲得MRNI在大腸桿菌中的高效可溶性表達(dá)。通過構(gòu)建含SUMO、IF2、GST等不同融合標(biāo)簽的八種重組表達(dá)載體,以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌自誘導(dǎo)表達(dá)及利用MagNi磁珠純化,采用低溫誘導(dǎo)提高重組蛋白表達(dá)量。進(jìn)一步研究該酶是否具有抑制RNase A,防止RNA被降解的作用,為核糖核酸酶抑制劑的生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliBL21(DE3)菌株、E.coliTrans I菌株 本實(shí)驗(yàn)室提供;HiFi DNA聚合酶、DNA Marker(15000 bp)、蛋白質(zhì)Marker(120 kDa)、核糖核酸酶抑制劑 北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、NotI NEB公司;二硫蘇糖醇(DTT)、氨芐青霉素(Ampr)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) Taraka公司;NP40 Sigma公司;溶菌酶 Amresco公司;核糖核酸酶A 北京沁源惠幟生物技術(shù)有限公司;MagNi Protein Purification Kit 北京諾貝奧生物技術(shù)有限公司;裂解緩沖液、ZYP+5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基[3](碳源為葡萄糖和α-乳糖) Thermo公司；實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建,特性[4]如表1所示。

T100 TM Thermal Cycler PCR儀 美國BIO-RAD公司;H2050R臺式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;Gds8000凝膠成像儀 美國Uvp公司;DK-8D電熱恒溫水槽、DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;DZP-102恒溫振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MRNI基因的擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) 通過MRNI基因在Genbank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的序列及所用載體的序列決定。分別于上、下游引物的5′端插入了BamHI和NotI酶切位點(diǎn)。上游引物P1:5′-TCCAGGG GCCCCTGGGATCCATGAGTCTTGACATCCAGTGTGAG

-3′,下游引物P2:5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGG CCGCTCAGGAAATGATCCTCAGGGAAG-3′,引物被送到上海生工生物有限公司進(jìn)行合成。以全基因合成的MRNI基因?yàn)槟０?利用P1、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的產(chǎn)物,并通過膠回收重新獲取基因片段,經(jīng)BamHI和NotI 酶切后進(jìn)行柱回收。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 通過T4DNA連接酶將其與經(jīng)BamHI和NotI酶切后的pNBE3C Ⅰ～Ⅷ表達(dá)載體相連,得到重組載體pNBE3C Ⅰ～Ⅷ-MRNI,并將其轉(zhuǎn)化至E.coliTrans I克隆感受態(tài)細(xì)胞中,于Ampr抗性平板涂布培養(yǎng)。經(jīng)過菌落 PCR 和酶切鑒定篩選陽性單克隆菌落,同時(shí)送至上海生工生物有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3 重組菌的自誘導(dǎo)表達(dá) 將測序成功的八種重組載體熱激轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中,于Ampr抗性平板涂布培養(yǎng),挑取單菌落,于Ampr抗性的 1 mL LB液體培養(yǎng)基中接種,37 ℃搖床培養(yǎng)16 h,再以1‰接種量于10 mL自誘導(dǎo)培養(yǎng)基[5-8]中接種,37 ℃150 r/min自誘導(dǎo)6 h,20 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h,離心收集菌體[9],12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白條帶。

1.2.4 重組蛋白的可溶性表達(dá)檢測 取1 mL 1.2.3中獲得的菌液,12000 r/min 5 min離心,收集菌體,加入含50 mmol/L Tris-HCl pH8.0的裂解緩沖液及濃度1 mg/mL的溶菌酶,懸浮菌體,過夜凍存,取出于37 ℃融化30 min,加入1%的500 mmol CaCl2、1%的1 mg/mL DNase,混勻后放于37 ℃水浴30 min,取出后加入1/10的5 mol NaCl,12000 r/min,離心5 min。向上清中加入少量磁珠,目的蛋白與其結(jié)合5 min后于磁力架上吸附,收集穿透峰;加入含10 mmol咪唑的Tris-HC1緩沖液漂洗雜蛋白,重復(fù)5次;加入含500 mmol咪唑的Tris-HC1緩沖液,結(jié)合5 min后洗脫目的蛋白[10]。將離心得到的沉淀、上清,純化的穿透峰及洗脫液[3]在12%聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣分析,選出高效表達(dá)的菌株。

1.2.5 融合蛋白MRNI的自誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

1.2.5.1 自誘導(dǎo)溫度對可溶性蛋白表達(dá)量的影響 向4瓶10 mL滅菌后的ZYP+5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入Ampr,以1‰接種量將菌液分別接種,37 ℃搖床培養(yǎng)測得600 nm分光光度值0.2左右時(shí),將其分別放至16、20、25、30 ℃搖床培養(yǎng)[11]至分光光度值達(dá)1.5左右時(shí),離心收集菌體,按照1.2.4中方法純化檢測可溶性MRNI及12%聚丙烯酰胺凝膠分析。

1.2.5.2 自誘導(dǎo)時(shí)間對可溶性蛋白表達(dá)量的影響 向20 mL滅菌后的ZYP+5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入Ampr,以1‰接種量將菌液分別接種,37 ℃搖床培養(yǎng)至600 nm分光光度值為0.2左右時(shí),放置20 ℃分別搖床培養(yǎng)12、14、16、17、18、20、21、22、23、24、26 h時(shí),收集菌體磁珠純化后取洗脫液進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.6 裂解菌體及MagNi磁珠純化 向100 mL滅菌后的ZYP+5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入Ampr,以1‰接種量將菌液分別接種,37 ℃搖床培養(yǎng)6 h,20 ℃培養(yǎng)24 h,離心得到沉淀。加入含50 mmol/L Tris-HC1 pH8.0的裂解緩沖液及1 mg/mL的溶菌酶,懸浮菌體。放于-20 ℃過夜凍存,取出于37 ℃融化30 min,加入1%的500 mmol/L CaCl2,1%的1 mg/mL DNase[12],混勻后放于37 ℃水浴30 min,取出后加入1/10的5 mol/L NaCl[13],12000 r/min離心5 min。收集上清按照1.2.4中的磁珠純化說明書操作步驟進(jìn)行純化。

1.2.7 純化后的IF2-MRNI的濃度測定 將純化后的蛋白通過PEG 2000濃縮,再經(jīng)透析除鹽,用BCA蛋白濃度測定法對IF2-MRNI濃度進(jìn)行測定,取20 μL待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品,加入200 μL BCA染色液,于37 ℃靜置30 min后,用酶標(biāo)儀測得562 nm處吸光值,以測得的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲得的蛋白加入儲存液,凍存至-20 ℃。

1.2.8 融合蛋白IF2-MRNI的活性檢測 通過使用基于瓊脂糖凝膠的測定來測量在RI存在下的核糖核酸活性。以購買的RI作對照,將不同體積的融合蛋白IF2-MRNI加入到含有50 mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L DTT的反應(yīng)混合物中[2],加入5 ng RNase A,在室溫孵育10 min,加入1 μg提取的植物總RNA。將混合物20 μL在室溫下孵育10 min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行RNA電泳,并通過溴化乙錠染色核實(shí)。如果RNA條帶完好,未降解,說明其具有抑制RNA酶降解RNA 的作用,證明其具有一定活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中涉及的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均重復(fù)3次;蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制均采用 Microsoft Office Excel(2007)軟件;蛋白濃度測定采用SoftMax Pro 6.3.1軟件,應(yīng)用 Adobe Photoshop CC 2014軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以全基因合成的MRNI基因?yàn)槟０逋ㄟ^PCR擴(kuò)增,在1%瓊脂糖凝膠電泳上可以看到一條清晰條帶大小約1383 bp(圖1),同預(yù)期目的片段大小相符。

圖1 PCR擴(kuò)增MRNI基因Fig.1 PCR amplification of MRNI gene注:M:DNA Marker;1:MRNI基因PCR產(chǎn)物。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

分別將pNBE Ⅰ～Ⅷ表達(dá)載體(圖2)及擴(kuò)增出的MRNI基因經(jīng)BamHI和NotI酶切后,經(jīng)T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化到E.coliTrans I中,于Ampr抗性平板涂布培養(yǎng),37 ℃過夜培養(yǎng),每種載體選取4個(gè)陽性菌落做菌落PCR檢測(圖3),確定重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 酶連重組表達(dá)載體Fig.2 Enzyme-linked recombinant expression vector注:M:DNA marker;1:PCR 擴(kuò)增的MRNI基因; 2～9:重組載體pNBE Ⅰ～Ⅷ。

圖3 菌落PCR鑒定重組表達(dá)載體Fig.3 Detection of the recombinant expression vector by PCR注:M:DNA marker;泳道1～4:重組質(zhì)粒pNBE I-MRNI;泳道5～8:重組質(zhì)粒pNBE II-MRNI;泳道9～12:重組質(zhì)粒pNBE IIII-MRNI;泳道13～16:重組質(zhì)粒pNBE IV-MRNI;泳道17～20:重組質(zhì)粒pNBE V-MRNI;泳道21～24:重組質(zhì)粒pNBE VI-MRNI;泳道25～28:重組質(zhì)粒pNBE VII-MRNI;泳道29～32:重組質(zhì)粒pNBE VIII-MRNI。

2.3 重組菌的自誘導(dǎo)表達(dá)

挑選檢測成功的菌株,按照質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中,篩選菌株接種后自誘導(dǎo)培養(yǎng),收集沉淀,12%聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示(圖4),pNBE I和pNBEVI載體并未表達(dá)目的蛋白,重組菌BL21(DE3)/pNBE II-MRNI、BL21(DE3)/pNBE III-MRNI、BL21(DE3)/pNBE IV-MRNI、BL21(DE3)/pNBE V-MRNI、BL21(DE3)/pNBE VII-MRNI、BL21(DE3)/pNBE VIII-MRNI表達(dá)的融合蛋白與期望基本一致,大小分別為69.6、90.0、105.0、66.1、67.3、90.0 kDa。

圖4 MRNI誘導(dǎo)表達(dá)的12%聚丙烯酰胺凝膠分析Fig.4 Analysis of MRNI induced expression of 12% polyacrylamide gel注:M:蛋白質(zhì) Marker;1～8:分別為載體 pNBE Ⅰ～Ⅷ的自誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌。

2.4 重組蛋白的可溶性表達(dá)鑒定

對1.3.3中得到的沉淀通過MagNi磁珠純化,對各重組菌表達(dá)可溶性MRNI的狀況進(jìn)行檢測,通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳可以看出(圖5),重組菌BL21(DE3)/pNBE II-MRNI、BL21(DE3)/pNBE III-MRNI、BL21(DE3)/pNBE V-MRNI、BL21(DE3)/pNBE VII-MRNI 經(jīng)過洗脫后蛋白條帶與期望值大小相符,分別是69.6、90、66.2、67.3 kDa。而從條帶上看雜蛋白含量最少的是重組菌BL21(DE3)/pNBE II-MRNI,重組蛋白IF2-MRNI表達(dá)量偏高,大小約69 kDa,同期望的分子質(zhì)量大小基本一致。接下來優(yōu)化此重組菌的培養(yǎng)條件,使其表達(dá)量提高。

圖5 MRNI可溶性表達(dá)的12%聚丙烯酰胺凝膠分析Fig.5 Analysis of soluble expression of MRNI by 12% polyacrylamide gel注:M:蛋白Marker;1～4:表達(dá)載體pNBE I的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;5～8:表達(dá)載體pNBE II的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;9～12:pNBE II的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;13～16:pNBE III的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;17～20:pNBE IV的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;21～24:pNBE V的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;25～28:pNBE VI的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;26～29:pNBE VII的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;30～32:pNBE VIII的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫。

2.5 重組蛋白IF2-MRNI自誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.5.1 自誘導(dǎo)溫度對可溶性蛋白表達(dá)量的影響 誘導(dǎo)溫度不僅影響菌體的生長,同時(shí)也影響著重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)[11]及包涵體的形成[14]。低溫誘導(dǎo)可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)[15]。通過12%聚丙烯酰胺凝膠可以看出,如圖中標(biāo)注所示,20 ℃時(shí)形成的包涵體較少,洗脫液中蛋白含量最高,所以在20 ℃時(shí)表達(dá)量相對較高,條帶單一。確定最佳誘導(dǎo)溫度是20 ℃(圖6)。

圖6 誘導(dǎo)溫度對可溶性MRNI濃度的影響Fig.6 Effects of induced temperature on soluble MRNI concentration注:M:預(yù)染蛋白質(zhì) Marker;1～4:16 ℃時(shí)誘導(dǎo)的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;5～8:20 ℃時(shí)誘導(dǎo)的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;9～12:25 ℃時(shí)誘導(dǎo)的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫;13～16:30 ℃時(shí)誘導(dǎo)的重組菌裂解的沉淀、上清、純化后的穿透和洗脫。

2.5.2 自誘導(dǎo)時(shí)間對可溶性蛋白表達(dá)量的影響 通過12%聚丙烯酰胺凝膠可以看出,誘導(dǎo)后菌體表達(dá)量因時(shí)間增加而變多[11],如圖7,在誘導(dǎo) 24 h 時(shí),MRNI 表達(dá)量最高,同時(shí)菌體內(nèi)的蛋白酶對重組蛋白的降解也會增加,所以過長時(shí)間的誘導(dǎo)對重組蛋白的表達(dá)反而有害[11],MRNI 的表達(dá)量也會降低,確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間是24 h。

圖7 不同表達(dá)時(shí)間對MRNI表達(dá)的影響Fig.7 Effect of different expression time on MRNI expression注:M:蛋白質(zhì) Marker;1～11:誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間分別為 12、14、16、17、18、20、21、22、23、24、26 h的菌體。

2.5.3 MagNi磁珠純化 如圖8所示,穿透中有極少量IF2-MRNI,但漂洗中幾乎看不到蛋白條帶,證明蛋白與磁珠結(jié)合情況較好,收集洗脫蛋白只有一條大小為是69.6 kDa的清晰帶,同期望一致,純化量高。

圖8 磁珠純化MRNI的12%聚丙烯酰胺凝膠分析Fig.8 12% polyacrylamide gel analysis of MRNI purified by magnetic beads注:M:蛋白質(zhì)Marker;1:菌體裂解后的沉淀;2:菌體裂解后的上清;3:純化穿透峰;4～7:純化雜蛋白漂洗;8～13:第1次到第6次分批次洗脫得到的MRNI。

2.5.4 重組蛋白 IF2-MRNI 的濃度測定 用酶標(biāo)儀測得562 nm處吸光值為2.9248,根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖9),可計(jì)算出所測蛋白濃度為3621.3 mg/L。

圖9 BCA蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 BCA protein concentration determination standard curve

2.5.5 融合蛋白IF2-MRNI的活性檢測 如圖10,泳道2、3、6、7、8的RNA均降解;由泳道4、5看出,加入購買的RI超過0.8 μL時(shí),RNA不會降解,由泳道9、10看出,純化后的IF2-MRNI加入超過1 μL時(shí),RNA不會降解。與購買的RI對比,可得酶活力大約為40 U/μL。

圖10 MRNI酶活性檢測Fig.10 Detection of MRNI enzyme activity注:M:DNA marker;泳道1:提取的植物葉片RNA;泳道2～5:加入體積為0.4、0.6、0.8、1.0 μL購買的RI;泳道6～10:加入體積分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL IF2-MRNI。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合標(biāo)簽的重組表達(dá)載體,通過磁珠純化法檢測可溶性表達(dá)情況,最終篩選出表達(dá)量高的重組菌BL21(DE3)(pNBEII-MRNI),通過優(yōu)化溫度和時(shí)間確定最佳自誘導(dǎo)條件:37 ℃培養(yǎng)6 h,20 ℃培養(yǎng)24 h。通過磁珠純化法檢測并得到表達(dá)量高的融合蛋白IF2-MRNI,濃縮脫鹽后利用BCA法測定其濃度為3621.3 mg/L。利用IF2-MRNI抑制RNA酶水解RNA的能力測定其活性,得到的融合蛋白酶活約為40 U/μL。為了實(shí)現(xiàn)IF2-MRNI的可溶性表達(dá),利用融合標(biāo)簽構(gòu)建表達(dá)載體,選取BL21(DE3)作為宿主菌及采用低溫誘導(dǎo)。但因蛋白質(zhì)性質(zhì)不同,促進(jìn)可溶性表達(dá)的方法自然不同,所以使MRNI達(dá)到最高表達(dá)量的方法還需深入探索。通過上述實(shí)驗(yàn)可知,低溫條件更有利于蛋白的正確折疊及可溶性表達(dá)。