3種殺菌處理對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和赭曲霉毒素A產(chǎn)生量的影響

彭青枝,楊冰潔,王璐榮,楊書珍,朱曉玲

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖北武漢 430070; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070)

炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)屬于曲霉屬黑色曲霉菌,能夠侵染葡萄、谷物、咖啡、可可和花生等食品原料[1],其中從葡萄中分離得到的炭黑曲霉數(shù)量最多[2]。炭黑曲霉不僅是引起葡萄果實(shí)腐爛變質(zhì)的腐敗菌,同時(shí)也是葡萄中真菌毒素赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的主要產(chǎn)生菌,廣泛存在于許多國(guó)家和地區(qū)的葡萄及其制品中,是造成葡萄酒中OTA污染的主要來(lái)源。OTA是自然界中最常見(jiàn)、毒素最強(qiáng)的真菌毒素之一,對(duì)人類和動(dòng)物有致畸[3]、致癌[4]、致突變[5]的風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重威脅了人類的健康,被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為2B致癌物[6]。因此,尋找控制炭黑曲霉污染的有效措施對(duì)于新鮮果實(shí)原料及其制品的安全生產(chǎn)具有重要意義。

真菌生長(zhǎng)及其毒素產(chǎn)生受物理、化學(xué)和生物等多方面因素的影響。目前果蔬采后生產(chǎn)中主要通過(guò)物理和化學(xué)途徑來(lái)控制病原真菌的發(fā)生。溫度處理、紫外處理和化學(xué)保鮮劑等方法對(duì)果蔬采后真菌病害具有良好的控制效果,被廣泛應(yīng)用于蘋果、葡萄和楊梅等果蔬的采后殺菌保鮮[7-8]。適宜的溫度處理能夠有效控制采后病原微生物的生長(zhǎng)和果蔬采后呼吸作用,延長(zhǎng)果蔬采后壽命,被廣泛應(yīng)用于菠菜、楊梅等的采后保鮮[9]。紫外線照射通過(guò)穿透微生物的細(xì)胞膜,導(dǎo)致微生物繁殖力降低或死亡[10-11],被作為綠色、安全的果蔬保鮮殺菌技術(shù)廣泛應(yīng)用于蘋果、櫻桃、葡萄、檸檬等果實(shí)的采后殺菌保鮮[12]?；瘜W(xué)殺菌處理由于操作方便、成本低廉、效果顯著,被廣泛應(yīng)用于果蔬采后真菌病害的控制[13]。其中,多菌靈、抑霉唑和咪鮮胺對(duì)于采后病原真菌具有廣譜的殺菌效果,在果蔬采后貯藏過(guò)程中廣泛使用,但有關(guān)這些殺菌劑處理對(duì)采后病原真菌毒素產(chǎn)生的相關(guān)報(bào)道鮮見(jiàn)[14-15]。Medina等[16]研究發(fā)現(xiàn)中等濃度的多菌靈處理雖然能夠顯著抑制炭黑曲霉的生長(zhǎng),但卻促進(jìn)了OTA的大量產(chǎn)生;史祥鵬等[17]也發(fā)現(xiàn)溫度處理對(duì)梨樹腐爛病菌黑腐皮殼菌的生長(zhǎng)和真菌毒素產(chǎn)生的影響并不一致。以上研究結(jié)果表明,如果采后殺菌處理使用不當(dāng),很有可能會(huì)刺激真菌毒素的大量產(chǎn)生,進(jìn)而影響果蔬采后的安全貯藏與加工[18-19]。但目前有關(guān)采后殺菌處理對(duì)病原真菌產(chǎn)生毒素影響的報(bào)道鮮見(jiàn)。因此,本文擬果蔬采后常見(jiàn)產(chǎn)毒病原真菌炭黑曲霉為對(duì)象,研究常見(jiàn)的采后殺菌處理(溫度處理、紫外照射處理、化學(xué)殺菌劑處理)對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和真菌毒素OTA產(chǎn)生的影響,以期為果蔬采后貯藏和加工過(guò)程中真菌毒素的有效控制提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株炭黑曲霉(CICC 40296)從葡萄上分離 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心,菌株用察氏培養(yǎng)基于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并在4 ℃條件下保存待用;硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂、乙腈、乙酸、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、甲酸等 其中甲酸為色譜純,其余均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。

EX20顯微鏡 寧波舜玉儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-18SI 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;高效液相色譜儀3000 賽默飛世爾科技;質(zhì)譜儀Sciex Triple QuadTM6500 美國(guó)Abel公司;色譜柱Acquity UPLC BEH C18 Waters公司;氮吹儀DCY-12B 金昌公司;

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子菌懸液的制備 炭黑曲霉菌在察氏培養(yǎng)基平板上于25 ℃下培養(yǎng)6 d,待充分產(chǎn)孢后,用含吐溫-80溶液10 mL輕輕洗下孢子,然后用3層無(wú)菌紗布過(guò)濾除掉菌絲,得到孢子菌懸液;然后再用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×106個(gè)/mL備用。

1.2.2 孢子萌發(fā)試驗(yàn) 將察氏培養(yǎng)基涂布于已滅菌的載玻片上,待培養(yǎng)基充分凝固后,吸取40 μL孢子菌懸液接種在察氏培養(yǎng)基上,然后將載玻片放置在培養(yǎng)皿(底部鋪一層吸水濾紙)中,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)7 h后觀察孢子萌發(fā)情況,并按下列公式計(jì)算孢子萌發(fā)率和不同處理對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率。

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn) 將12 mL察氏固體培養(yǎng)基加入到直徑7 cm培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)基充分凝固后,取4 μL菌懸液接種于培養(yǎng)基的正中央,然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)5 d時(shí),測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 炭黑曲霉 OTA的含量測(cè)定 將12 mL察氏固體培養(yǎng)基倒入至直徑7 cm培養(yǎng)皿中,待充分凝固后,取50 μL菌懸液涂布在培養(yǎng)基上,然后放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,取緊貼菌絲底部的培養(yǎng)基用于檢測(cè)OTA含量;每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值。OTA的含量測(cè)定采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)的方法進(jìn)行,毒素提取和檢測(cè)條件如下:

1.2.4.1 OTA的提取 準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)7 d的察氏固體培養(yǎng)基5 g于具塞離心管中,加入10 mL 1%(v/v)乙酸的乙腈和10 ml超純水,將所得溶液漩渦振蕩提取30 min,加入4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉,輕輕振蕩1 min,在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min,取上清液8 mL于40 ℃下氮吹至近干,殘余物質(zhì)用1 mL 70%(v/v)甲醇水復(fù)溶,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,濾液經(jīng) UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.2.4.2 OTA檢測(cè) 超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源,正離子模式(ESI+),質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),電離電壓3 kV,離子源溫度120 ℃,脫溶劑溫度380 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h,碰撞氣流量0.18 L/min,錐孔反吹氣流量50 L/h,離子對(duì)404.2/239,錐孔電壓70 V,碰撞電壓32 V。

1.2.5 采后殺菌處理?xiàng)l件

1.2.5.1 紫外殺菌 分別將接種炭黑曲霉菌懸液的察氏培養(yǎng)基平板,放置在光強(qiáng)為60 Lux的紫外光下照射0、15、30、45、60和75 min;以未照光處理為對(duì)照。然后按本文1.2.2,1.2.3,1.2.4中的方法進(jìn)行孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的評(píng)價(jià)。

1.2.5.2 溫度處理 將接種了炭黑曲霉菌懸液的察氏培養(yǎng)基平板分別放置在4、15、20、25、30、35 ℃溫度下培養(yǎng),以25 ℃下培養(yǎng)為對(duì)照。然后按本文1.2.2,1.2.3,1.2.4中的方法進(jìn)行孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的評(píng)價(jià)。

1.2.5.3 化學(xué)殺菌劑處理 分別將抑霉唑、多菌靈和抑霉唑加入察氏培養(yǎng)基中,采用對(duì)倍稀釋法稀釋,使抑霉唑濃度0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/mL,咪鮮胺濃度為0、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96 μg/mL,多菌靈濃度0、0.24、0.48、0.96、1.92、2.84 μg/mL,以不加藥的察氏培養(yǎng)基作為對(duì)照。然后按本文1.2.2,1.2.3,1.2.4中的方法進(jìn)行孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理繪圖,用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外處理對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)及OTA產(chǎn)生量的影響

本試驗(yàn)研究了不同紫外照射時(shí)間對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和真菌毒素OTA產(chǎn)生的影響。由圖1可知,紫外照射處理可以抑制炭黑曲霉的生長(zhǎng),且抑菌效果隨紫外照射時(shí)間延長(zhǎng)而提高,照射75 min時(shí),孢子萌發(fā)率和菌落生長(zhǎng)直徑分別為35.39%和1.7 cm,顯著低于未經(jīng)紫外照射處理的真菌孢子萌發(fā)率和菌落直徑(91.32%和5.2 cm)。表明紫外照射能夠抑制炭黑曲霉的生長(zhǎng)。有研究證明紫外照射能夠抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng),且隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率增加[20-21]。紫外線能夠抑制真菌生長(zhǎng)主要是由于破壞了微生物的DNA的結(jié)構(gòu),引發(fā)突變,使細(xì)胞的遺傳活性喪失,從而真菌生長(zhǎng)受到抑制[22]。但本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),紫外照射后炭黑曲霉的產(chǎn)毒規(guī)律與生長(zhǎng)規(guī)律并不一致。當(dāng)紫外照射時(shí)間為45 min時(shí),OTA的產(chǎn)生量最多,達(dá)到14.48 ng/g,是對(duì)照組的3.18倍,之后OTA的產(chǎn)生量隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。Ribeiro等[23]也發(fā)現(xiàn),一定強(qiáng)度的γ射線處理刺激了黃曲霉和赭曲霉產(chǎn)生大量的真菌毒素,推測(cè)可能與γ射線處理使真菌處于一定的脅迫條件有關(guān)。因此,在本試驗(yàn)中,中等時(shí)間的紫外處理可能使炭黑曲霉處于脅迫狀態(tài),進(jìn)而刺激了炭黑曲霉產(chǎn)生大量包括OTA在內(nèi)的次生代謝物質(zhì),以增強(qiáng)機(jī)體的防御能力。但長(zhǎng)時(shí)間的紫外處理會(huì)抑制甚至殺死炭黑曲霉,降低了炭黑曲霉的代謝活性,從而使OTA的產(chǎn)生量下降。

圖1 紫外照射對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和毒素產(chǎn)生的影響Fig.1 Effects of ultraviolet light irradiation on grow and toxins of A. carbonarius

2.2 溫度處理對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)及毒素產(chǎn)生量的影響

本試驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)溫度對(duì)炭黑曲霉的生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響。從圖2中看出,培養(yǎng)溫度對(duì)炭黑曲霉的孢子萌發(fā)和菌落直徑生長(zhǎng)有明顯的影響。4 ℃時(shí),炭黑曲霉的生長(zhǎng)被完全抑制;在4～25 ℃的范圍內(nèi),隨著溫度的升高,孢子萌發(fā)和菌落直徑都呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在25 ℃的條件下炭黑曲霉的孢子萌發(fā)率和菌落直徑達(dá)最大,分別為89.80%和5.51 cm。之后隨著溫度升高菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)會(huì)受到抑制,尤其在35 ℃下真菌生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制,孢子萌發(fā)率和菌落生長(zhǎng)直徑分別下降至69.12%和4.45 cm。

圖2 溫度處理對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響Fig.2 Effects of culture temperature on grow and toxins of A. carbonarius

溫度對(duì)炭黑曲霉產(chǎn)生OTA的影響與其對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響相似。4 ℃時(shí),培養(yǎng)基中未檢出OTA;在4～25 ℃的范圍內(nèi),隨著溫度的升高,OTA產(chǎn)生量也增加,25 ℃時(shí)OTA產(chǎn)生量最高,達(dá)到10.91 ng/g。當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí),隨著炭黑曲霉的生長(zhǎng)受到抑制,OTA產(chǎn)生量也大幅度下降。Oviedo等[24-25]在研究溫度對(duì)大豆中鏈格孢菌生長(zhǎng)與真菌毒素產(chǎn)生的影響時(shí),也發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)鏈格孢菌生長(zhǎng)的影響規(guī)律與對(duì)毒素產(chǎn)生的影響規(guī)律相一致,低溫和高溫均不利于鏈格孢菌的生長(zhǎng)和毒素的產(chǎn)生。Pose等[26]發(fā)現(xiàn)低溫(6 ℃)和高溫(35 ℃)均能顯著抑制鏈格孢菌在番茄合成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和鏈格孢毒素的產(chǎn)生,并認(rèn)為低溫有利于番茄制品的安全貯藏。因此,低溫貯藏和高溫處理是抑制炭黑曲霉生長(zhǎng)和降低OTA產(chǎn)生的有效措施。

2.3 采后化學(xué)殺菌劑處理對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響

化學(xué)殺菌劑通過(guò)抑制生物合成途徑中的酶活性,阻礙麥角甾醇的合成,導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡[27]。本試驗(yàn)中研究了抑霉唑、多菌靈、咪鮮胺3種常用化學(xué)殺菌劑對(duì)炭黑曲霉生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響。由圖3可以看出,所測(cè)試的多菌靈、抑霉唑、咪鮮胺對(duì)炭黑曲霉的菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,并呈濃度效應(yīng)。多菌靈、抑霉唑、咪鮮胺分別在0.48、0.48和 0.96 μg/mL時(shí),能夠完全抑制炭黑曲霉的孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)。而3種殺菌劑處理在低于最低抑菌濃度的條件下對(duì)OTA的產(chǎn)生具有顯著的促進(jìn)作用,并且隨著殺菌劑處理濃度的增加,OTA的產(chǎn)生量出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。多菌靈的濃度為0.12 μg/mL時(shí)OTA的產(chǎn)生量最大,達(dá)到12.24 ng/g,是對(duì)照的6.31倍,抑霉唑和咪鮮胺在0.06 μg/mL時(shí)的產(chǎn)生量最大,OTA的產(chǎn)生量達(dá)到10.62 ng/g和18.14 ng/g,是對(duì)照組的23.7倍和6.17倍。以上結(jié)果表明常見(jiàn)采后殺菌劑多菌靈、抑霉唑、咪鮮胺雖然在低濃度和中等濃度下能夠抑制炭黑曲霉的生長(zhǎng),但卻刺激了真菌毒素OTA的大量產(chǎn)生。張艷軍等[27]在研究嘧菌酯或多菌靈對(duì)禾谷鐮孢菌的影響時(shí),也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。有些化學(xué)殺菌劑對(duì)病原真菌毒素的產(chǎn)生確實(shí)存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象可能與化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期使用強(qiáng)化了病原真菌的防御系統(tǒng),通過(guò)分泌真菌毒素增強(qiáng)機(jī)體的抗藥性有關(guān)[28-29]。Terra等[30]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)普遍使用的化學(xué)殺菌劑只有在生產(chǎn)商推薦的藥劑使用劑量和條件下才能達(dá)到效果;殺菌劑的種類、劑量和環(huán)境溫度是影響殺菌劑抑制病原菌生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。因此,果蔬采后進(jìn)行化學(xué)殺菌處理時(shí),準(zhǔn)確評(píng)價(jià)化學(xué)殺菌劑的安全抑菌濃度對(duì)于減少真菌毒素的積累具有重要意義。

圖3 多菌靈處理對(duì)炭黑曲霉孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響Fig.3 Effect of carbendazim treatment on spore germination,mycelial growth and OTA production

圖4 抑霉唑處理對(duì)炭黑曲霉孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響Fig.4 Effect of imazalil treatment on spore germination,mycelial growth and OTA production

圖5 咪鮮胺處理對(duì)炭黑曲霉孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和OTA產(chǎn)生的影響Fig.5 Effect of prochloraz treatment on spore germination,mycelial growth and OTA production

3 結(jié)論

采后殺菌處理如紫外處理、溫度處理(0～35 ℃)和化學(xué)殺菌劑多菌靈、抑霉唑和咪鮮胺處理對(duì)炭黑曲霉的生長(zhǎng)均表現(xiàn)強(qiáng)烈的抑制作用,但對(duì)于OTA產(chǎn)生卻表現(xiàn)出不同的影響。較短時(shí)間的紫外照射處理(紫外強(qiáng)度60 Lux,處理時(shí)間為45 min)或中等劑量的化學(xué)殺菌劑處理(多菌靈,0.96 μg/mL;抑霉唑和咪鮮胺,0.06 μg/mL)會(huì)刺激OTA的大量產(chǎn)生。而炭黑曲霉的最適生長(zhǎng)溫度與OTA最適產(chǎn)生溫度相一致。因此,合理的貯藏溫度和殺菌處理?xiàng)l件對(duì)于采后果蔬的安全生產(chǎn)具有十分重要的作用。