硬毛粗蓋孔菌產(chǎn)漆酶條件優(yōu)化及其對日落黃的降解作用

宋麗麗,張志平,王光路,楊 旭,張靖楠

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002)

漆酶(Laccase,ρ-diphenoloxidase,EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,廣泛存在于植物、動物、昆蟲、細菌和真菌中,漆酶通過獲得O2催化鄰對位苯二酚、多酚、對苯二胺、抗壞血酸等物質(zhì)的氧化,使之生成相應(yīng)的苯醌和水[1-3]。由于漆酶具有廣泛的底物專一性,可催化多種芳香族化合物,在造紙工業(yè)、環(huán)境保護、食品工業(yè)、生物傳感器、生物監(jiān)測等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4]。在食品工業(yè)中,漆酶主要在果汁加工、葡萄酒釀造、面粉改良、食用菌栽培、食品檢測、食品廢水處理等方面具有重要的應(yīng)用價值,是當(dāng)今研究的熱點[5]。關(guān)于漆酶的研究多集中于擔(dān)子菌門(Basidiomycete)的白腐真菌(White rot fungi),而真菌漆酶活性受到多種條件的影響[6]:碳源或氮源的種類及濃度;金屬離子的種類及濃度(如Cu2+);誘導(dǎo)物,如藜蘆醇、阿魏酸等;培養(yǎng)條件,如溫度和pH;菌株特性等。盡管自然界中漆酶分布廣泛,但高產(chǎn)漆酶菌株并不多,通過優(yōu)化培養(yǎng)條件提高漆酶產(chǎn)量仍然是主要的研究手段[7]。

食用合成色素從結(jié)構(gòu)上可以分為偶氮類和非偶氮類兩類,我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)使用的偶氮類色素主要有檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅等[8]。日落黃又名晚霞黃、夕陽黃、食用色素3號、橘黃等,其分子結(jié)構(gòu)見圖1,日落黃作為一種人工合成食品添加劑,被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和藥物的著色[9]。由于日落黃具有耐熱、耐光性強,難于自然降解,且偶氮類合成色素多分子中含有偶氮鍵和芳香環(huán),如超量違規(guī)使用則對人體造成危害[10]。因此需尋求高效綠色降解方法,以減少偶氮類合成色素對人體的傷害及對環(huán)境的污染。

圖1 日落黃的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of sunset yellow

硬毛粗蓋孔菌(Funaliatrogii)屬于非褶菌目多孔菌科粗毛蓋孔菌屬,產(chǎn)漆酶活力較強,在漆酶資源開發(fā)、染料脫色等方面具有較大的應(yīng)用前景[11-12]。本文以硬毛粗蓋孔菌為出發(fā)菌株,研究培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件對該菌產(chǎn)漆酶活性的影響,并研究漆酶粗酶液對合成色素日落黃的降解,對今后漆酶資源在食品行業(yè)開發(fā)具有重要的理論意義和廣泛的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硬毛粗蓋孔菌(F.trogii)菌株 由鄭州輕工業(yè)學(xué)院生物能源與系統(tǒng)生物學(xué)研究室提供;2,2′-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、偶氮合成色素日落黃(Sunset yellow) 購于美國Sigma公司;葡萄糖、乳糖、氯化銨、酒石酸銨、硫酸銅、曲酸等 購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司;馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基),馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基) 購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,NH4Cl 2.5,K2HPO43,MgSO4·7H2O 0.2,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

UV-1800雙光速紫外-可見光光度計 上海欣茂儀器有限公司;SW-CJ-1D凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LRH-1500F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;QYC-2012C恒溫?fù)u床 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 將斜面菌株接種到PDA平板中,28 ℃下培養(yǎng)至菌絲體長滿整個平板(約7 d),用無菌打孔器取3塊接種塊(直徑1cm)接入PDB培養(yǎng)基中,150 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 d,為一級種子液。

1.2.2 硬毛粗蓋孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶 將5 mL一級種子液接入100 mL已滅菌的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)中,28 ℃、150 r/min條件下,培養(yǎng)12 d,期間對漆酶活性峰值進行監(jiān)測,以確定最佳發(fā)酵時間,進行后續(xù)實驗。

1.2.3 漆酶粗酶液制備 發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)束后,取發(fā)酵液,8000 r/min、4 ℃離心10 min,上清液即為漆酶粗酶液。經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定其漆酶活性。

1.2.4 漆酶活力的測定 反應(yīng)體系為1.5 mL適當(dāng)稀釋(使吸光度范圍為0.2～0.8)的粗酶液和1.5 mL ABTS(50 mmol/L,pH4.8)在420 nm處室溫下測定吸光度,每15 s記錄一個數(shù)據(jù),測定3 min內(nèi)反應(yīng)液的吸光度變化[13]。漆酶(Lac)酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化底物的μmol數(shù)(ε420=3.6×104L/mol/·cm)為一個酶活力單位(U)。酶活以U/mL表示。

1.2.5 生物量的測定 以菌絲體干重表示,發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min室溫離心10 min、蒸餾水洗滌后收集菌絲體,置70 ℃烘箱中干燥48 h至恒重(以g/L表示)[14]。

1.2.6 漆酶發(fā)酵條件選擇

1.2.6.1 最適碳源的選擇 基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別以20 g/L乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉、玉米淀粉替代葡萄糖作為唯一碳源,培養(yǎng)基其它成分不變,將5 mL一級種子液接入基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng),以1.2.2實驗確定發(fā)酵時間為8 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活。在確定最適碳源的基礎(chǔ)上,分別比較不同濃度(5、10、15、20、25、30、35 g/L)碳源添加量對菌體產(chǎn)漆酶的影響。

1.2.6.2 最適氮源的選擇 基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別以2.5 g/L酒石酸銨、硝酸鉀、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏替代氯化銨為唯一氮源,培養(yǎng)及測定條件同1.2.6.1。在確定最適氮源的基礎(chǔ)上,分別比較不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L)氮源添加量對菌體產(chǎn)漆酶的影響。

1.2.6.3 Cu2+及誘導(dǎo)劑的選擇 在確定碳、氮源種類及含量的基礎(chǔ)上,在培養(yǎng)基中加入CuSO4,分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中Cu2+終濃度為0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mmol/L,測定漆酶酶活。選擇鄰苯二酚、藜蘆醇、香蘭素、愈創(chuàng)木酚、阿魏酸作為誘導(dǎo)劑,發(fā)酵第3 d加入培養(yǎng)基,控制其終濃度均為1 mmol/L,測定漆酶酶活。培養(yǎng)及測定條件同1.2.6.1。

1.2.6.4 最適培養(yǎng)條件的選擇 在確定培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上,調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度分別為26、28、30、32、34、37 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)8 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活;調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH3、4、5、6、7、8、9,30 ℃,150 r/min搖床培養(yǎng)8 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活;調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速分別為0(靜置培養(yǎng))、50、100、150、200、250、300 r/min,培養(yǎng)基初pH為6,30 ℃培養(yǎng)8 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活。

1.2.7 漆酶粗酶液對日落黃的降解 以1.2.6確定的漆酶最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上,參考徐春燕等[15]實驗方法,研究漆酶粗酶液對日落黃的降解影響。其中降解反應(yīng)體系為200 U/mL粗酶液,50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8),日落黃濃度分別為50、100、200、400、600、800 mg/L。30 ℃恒溫靜置避光反應(yīng),分別在反應(yīng)的第0、0.5、1、2、3、5、10、24 h測定日落黃在其最大吸收波長處的吸光值。日落黃脫色率按如下方法計算:

式中,A0為對照的吸光度,At為反應(yīng)t小時后樣品的吸光度。以滅活的酶液為對照。

1.2.8 漆酶介體及抑制劑對日落黃降解的影響 分別選擇100和600 mg/L日落黃作為底物終濃度,在反應(yīng)體系中添加200 μL 10 mmol/L ABTS,其它條件同1.2.7,對比漆酶與漆酶-介體系統(tǒng)對日落黃的脫色情況。在漆酶粗酶液中添加曲酸,使其終濃度分別達到0、10、20、30、40、50、100 mmol/L,測定在該濃度下漆酶酶活;取被不同濃度曲酸抑制的漆酶粗酶液,日落黃底物濃度為100 mg/L,測定漆酶對日落黃的脫色情況,反應(yīng)條件同1.2.7。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗平行3次,采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬毛粗蓋孔菌的生長曲線及產(chǎn)酶曲線

如圖2所示,在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物量逐漸增加,在7～10 d生物量基本穩(wěn)定,此后菌體生物量逐漸降低,推測是由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分耗盡,菌體自溶導(dǎo)致。在菌體培養(yǎng)初期(0～4 d),生物量快速增加,而漆酶活力較低(<5 U/mL),漆酶本身作為一種誘導(dǎo)酶,其分泌及活性受到菌體生長及代謝的影響,菌體快速生長階段則漆酶分泌量較低,只有當(dāng)菌體達到一定濃度時,才會啟動漆酶合成[16]。菌體培養(yǎng)5 d后漆酶活力快速提升,在第8 d達到最高,為27.50 U/mL,此后漆酶活性逐漸降低,因此將硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶時間定為8 d。

圖2 培養(yǎng)時間對硬毛粗蓋孔菌菌絲體生長及漆酶活力的影響Fig.2 Effect of culture period on mycelial growth and laccase activity of F. trogii

2.2 漆酶發(fā)酵條件的選擇

2.2.1 碳源及濃度對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 單糖利于微生物的生長利用,但不利于漆酶的分泌,多糖難以被直接利用,影響菌體生長,但作為遲效碳源,有利于漆酶的分泌[17]。本研究中,玉米淀粉對硬毛粗蓋孔菌產(chǎn)漆酶的促進作用最強,漆酶活力達到最高,為32.53 U/mL,其次是甘油,由于甘油作為一種小分子,易于被細胞利用,因此同樣呈現(xiàn)出促進漆酶發(fā)酵的能力。硬毛粗蓋孔菌對多糖的利用能力較強,因此選擇以玉米淀粉作為最適碳源。分別比較不同濃度玉米淀粉對菌體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響,結(jié)果如圖3B所示,由于碳源缺乏,低濃度玉米淀粉(如5 g/L)導(dǎo)致菌體生長不足進而影響漆酶的分泌。隨著碳源濃度的升高,漆酶活力逐漸增加,當(dāng)玉米淀粉濃度為25 g/L,漆酶活力達到最大,隨后反而降低,因此選擇以25 g/L玉米淀粉作為最適碳源添加濃度。

圖3 碳源種類(A)及含量(B)對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響Fig.3 Effect of carbon sources and concentrations on the laccase production of F. trogii

2.2.2 氮源及濃度對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 不同氮源種類對菌體產(chǎn)漆酶的影響如圖4A所示,有機氮源對漆酶的發(fā)酵優(yōu)于無機氮源,與陶君等[18]的研究結(jié)果一致。無機氮源中硝酸鉀和尿素對漆酶的分泌不利,推測可能由于菌株受不同氮源誘導(dǎo)產(chǎn)漆酶的效應(yīng)不同,而酒石酸銨對硬毛粗蓋孔菌產(chǎn)漆酶促進作用較強,可見菌體對銨態(tài)氮的利用優(yōu)于硝態(tài)氮。有機氮源中蛋白胨對漆酶的促進作用最強,漆酶活力達46.23 U/L,因此選擇以蛋白胨作為最佳氮源。分別加入不同濃度的蛋白胨,比較氮源濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響,結(jié)果如圖4B,漆酶活力隨氮源濃度升高而增加,當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹? g/L,漆酶活力達到最高,為51 U/mL,繼續(xù)增加濃度漆酶活力反而下降。因此,本研究中選擇以2 g/L蛋白胨作為最適氮源添加濃度。

圖4 氮源種類(A)及含量(B)對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources and concentration on the laccase production of F. trogii

2.2.3 Cu2+及誘導(dǎo)劑對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 漆酶作為一種含銅多酚氧化酶,銅離子作為其酶活中心,能通過誘導(dǎo)基因表達、翻譯和翻譯后調(diào)控等方式調(diào)控漆酶的合成[19-21]。圖5表明低濃度Cu2+對漆酶有較強的誘導(dǎo)作用,漆酶活力隨著Cu2+濃度增加而增強,當(dāng)Cu2+濃度為1.5 mmol/L,漆酶活力達到最高,為121 U/mL,是未誘導(dǎo)前的2.52倍,繼續(xù)增加Cu2+濃度,漆酶活性呈下降趨勢,高濃度Cu2+對菌體生長有抑制作用,不利于漆酶的生產(chǎn)。因此選擇以1.5 mmol/L作為Cu2+最適添加濃度。

圖5 Cu2+濃度對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響Fig.5 Effect of copper ion concentrations on the laccase production of F. trogii

漆酶作為一種誘導(dǎo)酶,加入誘導(dǎo)劑通?？梢蕴岣咂崦傅纳a(chǎn)活力,由于多數(shù)誘導(dǎo)劑對菌體生長不利,因此誘導(dǎo)劑通常在菌體生長一段時間后加入[22]。由圖6可知,不同種類的誘導(dǎo)劑對硬毛粗蓋孔菌產(chǎn)漆酶均有促進作用,其中香蘭素的促進作用最強,其漆酶活力較對照提高了92%。

圖6 不同誘導(dǎo)劑對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響Fig.6 Effects of inducers on the laccase production of F. trogii

2.2.4 培養(yǎng)條件對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 在確定培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上,進一步考察培養(yǎng)條件對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響,主要條件有溫度(圖7A)、初始pH(圖7B)和搖床轉(zhuǎn)速(圖7C)。結(jié)果表明,培養(yǎng)溫度在28～32 ℃之間,漆酶活力均較高,培養(yǎng)溫度高于30 ℃時,漆酶活力隨著溫度升高呈現(xiàn)下降趨勢,因此選擇以30 ℃作為最佳培養(yǎng)溫度。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH偏堿性條件下(pH為8～9),漆酶活力下降明顯,pH在4～7范圍內(nèi),酶活較高,pH為6時漆酶活力最高,研究報道初始pH為酸性對菌體發(fā)酵產(chǎn)漆酶有利,菌種發(fā)酵產(chǎn)漆酶多為偏酸性環(huán)境(pH4.5～6)[23],因此選擇pH6.0作為培養(yǎng)基初始pH。

圖7 不同培養(yǎng)條件對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響Fig.7 Effect of culture conditions on the laccase production of F. trogii注:A:溫度;B:初始pH;C:搖床轉(zhuǎn)速。

由圖7C可知,當(dāng)靜置培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速為0),培養(yǎng)基中溶氧量較低,漆酶生產(chǎn)較低,硬毛粗蓋孔菌為嚴(yán)格好氧菌,氧氣對菌體生長及產(chǎn)酶至關(guān)重要[24]。隨著搖床轉(zhuǎn)速提升,培養(yǎng)基中溶氧量逐漸增多,漆酶活力隨之提高,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速超過200 r/min時,漆酶活力下降,轉(zhuǎn)速過高會造成剪切力過大,不利于菌體的生長。因此選擇以200 r/min作為最適搖床轉(zhuǎn)速。

通過研究培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件對硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響,確定其最適發(fā)酵條件為:碳源為玉米淀粉(25 g/L),氮源為蛋白胨(2 g/L),Cu2+添加量為1.5 mmol/L,誘導(dǎo)劑為香蘭素(1 mmol/L),培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH為6.0,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,在此條件下硬毛粗蓋孔菌發(fā)酵8 d,其胞外漆酶活力最高為329 U/mL,是初始培養(yǎng)條件下的11.96倍。由于漆酶的活性受到培養(yǎng)因素等多方面的影響,因此優(yōu)化培養(yǎng)條件是漆酶工作的研究重點。楊詠潔等[25]通過研究碳源、氮源及pH等不同培養(yǎng)條件對火紅密孔菌分泌產(chǎn)漆酶能力的影響,經(jīng)優(yōu)化后,漆酶活力最高達到238 U/mL,徐春燕等[15]研究培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑、Cu2+對膠質(zhì)射脈革菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,發(fā)現(xiàn)甘草渣與Cu2+復(fù)合誘導(dǎo)作用下,膠質(zhì)射脈革菌胞外漆酶活力最高達到325.1 U/mL。本研究中比較培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件對硬毛粗蓋孔菌產(chǎn)漆酶的影響,其胞外漆酶活力較初始培養(yǎng)條件有顯著提升,基于此,進一步考察漆酶對食用合成色素日落黃的降解脫色情況。

2.3 漆酶對不同濃度日落黃脫色效果比較

提取發(fā)酵后的粗酶液,考察漆酶粗酶液對不同濃度日落黃脫色效果的影響,結(jié)果如圖8,在低濃度水平下(50～200 mg/L),漆酶對日落黃的降解顯著,10 h脫色率均達到90%以上,24 h后對50、100、200 mg/L日落黃的脫色率分別為95.35%、94.45%、91.34%。隨著日落黃濃度的增加,漆酶對其脫色率逐漸降低。當(dāng)日落黃濃度達到800 mg/L時,反應(yīng)體系在10 h即達到飽和,脫色率基本保持不變。由于高濃度色素條件下,漆酶活性中心達到飽和,同時色素本身對漆酶的催化作用有負(fù)面影響,最終造成其脫色率較低[26]。鄭苗苗等[27]研究了紅平菇漆酶對不同合成染料的降解,漆酶對40 mg/L偶氮類甲基橙24 h的降解率為45%,本研究中,硬毛粗蓋孔菌胞外漆酶對不僅偶氮類色素的脫色作用顯著,并且可以耐受較高的底物濃度(800 mg/L),表明該漆酶在偶氮類色素降解方面具有較大的應(yīng)用前景。

圖8 漆酶粗酶液對不同濃度日落黃的降解Fig.8 The decolorization of crude laccase to different concentrations of sunset yellow

2.4 漆酶介體及抑制劑對日落黃脫色的影響

為進一步驗證漆酶對日落黃的脫色,分別考察了漆酶介體ABTS及漆酶抑制曲酸對日落黃脫色的影響。

2.4.1 ABTS對日落黃的脫色影響 高活性ABTS不僅是漆酶的特殊底物,也是使用廣泛的介質(zhì)之一,ABTS與漆酶形成LMS(laccase mediator system),ABTS充當(dāng)“電子梭”,可在漆酶與底物之間發(fā)揮電子傳遞的作用,不僅拓寬作用底物范圍,同時提高漆酶的催化效率[28]。本研究分別選擇100和600 mg/L日落黃作為底物濃度,對比漆酶與漆酶-介體系統(tǒng)(LMS)對日落黃的脫色情況,結(jié)果如圖9,漆酶-介體系統(tǒng)可顯著提升日落黃的降解效率,日落黃低濃度體系下(100 mg/L)3 h脫色率已達到87.54%,5 h脫色率已基本達到平衡,當(dāng)日落黃濃度為600 mg/L時,漆酶-介體系統(tǒng)對日落黃的脫色作用增強,最終脫色率為92.45%,對比不添加介體系統(tǒng)的脫色率僅為84.45%。小分子介體(ABTS)的加入,不但可以提升漆酶對日落黃的脫色效率,而且還可以加快底物的脫色速率,降低高濃度底物對漆酶的抑制作用。

圖9 漆酶介體對日落黃脫色的影響Fig.9 The effect of laccase mediator on decolorizaiton of sunset yellow

2.4.2 抑制劑曲酸對漆酶降解日落黃的影響 曲酸是漆酶特異性的抑制劑,在反應(yīng)體系中加入曲酸對漆酶活性產(chǎn)生抑制作用[29]。結(jié)果如圖10所示,隨著曲酸濃度的升高,漆酶活力逐漸被抑制,當(dāng)曲酸濃度達到100 mmol/L時,與未添加曲酸對照相比,漆酶活力喪失了93.20%。由于曲酸的加入使得漆酶活性受到抑制,日落黃的脫色率也隨之降低,當(dāng)曲酸濃度為100 mmol/L時,日落黃脫色率僅為7.14%,較未添加曲酸的對照組降低了92.57%。表明漆酶在對日落黃的降解脫色中發(fā)揮了重要作用。

圖10 不同濃度曲酸對漆酶酶活的抑制及日落黃脫色的影響Fig.10 The effect of different concentrations of kojic acid on laccase activity inhabition and decolorization of sunset yellow

3 結(jié)論

硬毛粗蓋孔菌最適發(fā)酵產(chǎn)漆酶條件為:碳源為玉米淀粉(25 g/L),氮源為蛋白胨(2 g/L),Cu2+添加量為1.5 mmol/L,誘導(dǎo)劑為香蘭素(1 mmol/L),培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH為6.0,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,培養(yǎng)8 d后漆酶活力最高為329 U/mL,是初始培養(yǎng)條件下的11.96倍。漆酶粗酶液對日落黃顯示出較強的降解脫色作用,并可耐受較高的底物濃度,該漆酶對偶氮類色素具有較好的降解脫色效果。漆酶介體ABTS的加入可顯著提升漆酶對日落黃的脫色速率及脫色效率:當(dāng)日落黃濃度為100 mg/L時,5 h脫色率基本已達到平衡,600 mg/L日落黃底物濃度下脫色率可達92.45%;而漆酶抑制劑曲酸的加入降低了漆酶活性,當(dāng)曲酸濃度為100 mmol/L時,日落黃脫色率僅為7.14%,表明漆酶在偶氮類合成色素降解脫色中發(fā)揮了重要作用。硬毛粗蓋孔菌作為產(chǎn)漆酶優(yōu)勢菌株,對今后漆酶在合成色素降解的應(yīng)用具有重要的意義。