納豆激酶微膠囊制備及其釋放與Caco-2細(xì)胞模型吸收的評價(jià)

鄧柳艷,張建華

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

納豆激酶(Nattokinase)最初分離自日本發(fā)酵食品納豆,是一種由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶[1],由275個(gè)氨基酸組成,具有很好的溶栓效果[2]。研究發(fā)現(xiàn),納豆激酶口服攝入后[3],主要在小腸部位被吸收[4],但納豆激酶作為生物大分子,易被胃腸道中蛋白酶水解、在小腸中不易被吸收,因此,生物利用度低[5]。為提高納豆激酶在人體胃腸道中的穩(wěn)定性,有研究者采用明膠、阿拉伯膠或海藻酸鈉等傳統(tǒng)天然壁材制備納豆激酶微膠囊,但粒徑多為微米級,很少能夠達(dá)到納米級別(10～1000 nm)[6-7]。納米級微膠囊具有腸胃刺激小、穩(wěn)定性高、可靶向運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn),是促進(jìn)包埋物吸收的有效方式。

此外,小腸絨毛壁的受體轉(zhuǎn)運(yùn)吸收等也是常見的吸收促進(jìn)方式。人體小腸絨毛上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等可表達(dá)葉酸(folic acid,FA)受體[8-9],葉酸可通過與上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入機(jī)體,如果能將其與高聚物連接作為微膠囊壁材,則有望促進(jìn)其包埋物的吸收。研究發(fā)現(xiàn),通過化學(xué)修飾可將葉酸分子的羧基與聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)中PEG的氨基端連接[10],得到葉酸靶向壁材FA-PEG-PLGA。PEG-PLGA是由聚乙二醇(PEG)和聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)經(jīng)化學(xué)合成得到的高分子聚合物,無免疫原性[11],且具有很好的生物降解性及緩釋特性,是納米級靶向微膠囊壁材的理想選擇[12],已成功用于抗腫瘤藥物[13]及胰島素[14]等蛋白類物質(zhì)的裝載及靶向運(yùn)輸。

因此,本實(shí)驗(yàn)將以PEG-PLGA為壁材,以包封率為指標(biāo),通過正交試驗(yàn)探索雙重乳液蒸發(fā)法制備納豆激酶微膠囊的最適條件,然后在此條件下制備PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊,并測定兩者表征參數(shù)及體外緩釋效果;最后,采用Caco-2細(xì)胞對兩種納豆激酶微膠囊的細(xì)胞毒性、釋放及細(xì)胞吸收效果進(jìn)行評價(jià),以期對制備納米級葉酸靶向納豆激酶微膠囊的可行性及其促進(jìn)細(xì)胞吸收的效果進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆激酶(100,000 FU/g) 廣州雙駿生物科技有限公司饋贈;葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(FA-PEG-PLGA) 西安瑞禧生物科技有限公司;聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA) 濟(jì)南岱罡生物工程有限公司;聚乙烯醇(PVA) 上海麥克林生化科技有限公司;Caco-2細(xì)胞系 實(shí)驗(yàn)室凍存;胎牛血清 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA試劑盒 上海生物技術(shù)有限公司;堿性磷酸酶試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline(DPBS)緩沖液、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液 美國Gibco公司;香豆素-6、熒光素鈉等 均為國產(chǎn)分析純。

KMO2磁力攪拌器 德國IKA公司;Nano S90納米粒度分析儀 英國Malvern公司;Omni納米粒度Zeta電位儀 美國BrookHaven公司;L5S棱光紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;5424R低溫高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;Innova 44恒溫?fù)u床 德國Eppendorf公司;311恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;STED 3X活細(xì)胞超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙重乳液蒸發(fā)法制備納豆激酶微膠囊 初級乳液制備:取一定量的FA-PEG-PLGA和PEG-PLGA兩種多聚物分別溶解于乙酸乙酯/氯仿(1∶1,v/v)中,備用;取納豆激酶粉末溶于Tris-HCl緩沖液(pH7.4),得10 mg/mL 納豆激酶溶液;分別取1 mL納豆激酶溶液加入5 mL上述兩種多聚物溶液中,1200 r/min磁力攪拌5 min;接著將兩種混合液分別于10000 r/min條件下均質(zhì)5 min,得W/O型初級乳液。

二級乳液制備:將上述兩種初級乳液分別逐滴加入至一定濃度的PVA溶液(pH7.0)中,并于1200 r/min、4 ℃條件下磁力攪拌5 min;接著于一定轉(zhuǎn)速下均質(zhì)一定時(shí)間,得到兩種W/O/W型二級乳液[16];最后將所得乳液攪拌至有機(jī)試劑完全揮發(fā),多聚物及PVA成膜形成微膠囊。

納豆激酶微膠囊粉末:分別將上述所得乳液于35250×g條件下4 ℃離心30 min,收集沉淀;接著用蒸餾水重懸沉淀、離心,重復(fù)三次;收集三次的上清液采用BCA試劑盒測定蛋白含量,收集沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥,即得FA-PEG-PLGA和PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊粉末[15]。

根據(jù)蛋白質(zhì)含量按下式計(jì)算納豆激酶的包封率。

包封率(%)=(M0-M1)×100/M0

式中:M0為納豆激酶初始含量(mg),M1為上清液中未包埋的納豆激酶含量(mg)。

1.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化微膠囊制備條件及微膠囊表征 以壁材(PEG-PLGA)濃度A、聚乙烯醇(PVA)濃度B、二級均質(zhì)轉(zhuǎn)速C和二級均質(zhì)時(shí)間D為因子,PEG-PLGA納豆激酶微膠囊包封率為指標(biāo),采用如表1所示正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)探究最適制備條件。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 The orthogonal experimental designTable L9(34)

參考Chen等[13]和Jain等[14]的研究結(jié)果,葉酸的結(jié)合與否對微膠囊的制備及物理性質(zhì)無顯著影響。因此,采用PEG-PLGA所得制備條件分別以PEG-PLGA、FA-PEG-PLGA為壁材制備兩種納豆激酶微膠囊,最后分別采用納米力度測定儀測定微膠囊平均粒徑和多分散系數(shù)(PDI),納米粒度Zeta電位儀測定ζ電位。

1.2.3 香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊制備 采用1.2.2中所得條件分別以PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA為壁材,以香豆素-6為熒光探針制備兩種納豆激酶示蹤微膠囊[16]。其中,香豆素-6與多聚物按質(zhì)量比1∶200溶解于乙酸乙酯/氯仿(v∶v=1∶1)中,其余步驟與1.2.1相同,制備所得香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊用于Caco-2吸收實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 微膠囊體外模擬緩釋 人體胃環(huán)境模擬[14]:分別將兩種納豆激酶微膠囊溶于Tris-HCl緩沖液(pH2.0),置于37 ℃搖床(50 r/min)中孵育2 h。分別于0.5、1和2 h時(shí)取出1 mL緩釋液,26475×g離心15 min,收集上清測定納豆激酶含量(M1),按下式計(jì)算納豆激酶微膠囊的釋放率:

釋放率(%)=(M1/M)×100,其中：M為微膠囊中納豆激酶初始質(zhì)量。

人體腸道環(huán)境模擬:取上述酶解液,調(diào)節(jié)pH至7.0,并加入PBS緩沖液(pH7.0)至100 mL,置于37 ℃搖床中繼續(xù)孵育,并分別于2、3、5、9、12、15、18、21和24 h取1 mL上述反應(yīng)液,測定納豆激酶含量并計(jì)算納豆激酶釋放率。

1.2.5 納豆激酶微膠囊細(xì)胞毒性評價(jià) 以Caco-2細(xì)胞存活率為指標(biāo),在樊佳新等[17]所建立的方法,采用MTT比色法對兩種納豆激酶微膠囊的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)。

1.2.6 Caco-2單層細(xì)胞模型的建立與評價(jià)

1.2.6.1 Caco-2單層細(xì)胞模型的建立 取對數(shù)期Caco-2細(xì)胞,按105個(gè)/孔分別接種于12孔的Transwell小室頂側(cè)(apical,AP)和基底側(cè)(basolateral,BL),加入1.5 mL DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清);嚴(yán)格按照21 d培養(yǎng)規(guī)程,前兩周隔天更換培養(yǎng)基,之后每天更換培養(yǎng)基[18]。

1.2.6.2 Caco-2單層細(xì)胞模型評價(jià) 為評價(jià)Caco-2單層細(xì)胞模型建立效果,實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance,TEER)、標(biāo)志物(熒光素鈉)透過率和細(xì)胞極性(堿性磷酸酶活性)為指標(biāo),評價(jià)單層細(xì)胞模型的完整性及分化狀況。其中,采用跨膜電阻儀測定TEER值;按照袁秀妍等[19]方法,分別測定AP→BL和BL→AP兩個(gè)方向上熒光素鈉的累積透過率;采用堿性磷酸酶試劑盒分別測AP側(cè)和BL側(cè)堿性磷酸酶的活性,并計(jì)算兩側(cè)(AP/BL)的酶活比值。

1.2.7 Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)[20]:AP→BL方向,AP側(cè)加入0.5 mL相同濃度不同種類的香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊溶液,BL側(cè)分別加入1.5 mL HBSS緩沖液;BL→AP方向,AP側(cè)加入1.5 mL HBSS緩沖液;BL側(cè)分別加入0.5 mL相同濃度不同種類的香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊溶液。分別于培養(yǎng)30、60、120和180 min時(shí)收集AP、BL兩側(cè)反應(yīng)液,采用分光光度法[21]測定其中香豆素-6的含量,計(jì)算AP→BL方向的頂側(cè)表觀滲透系數(shù)Papp(AP→BL)、BL→AP方向基底側(cè)表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)及兩個(gè)方向上表觀滲透系數(shù)比值Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)。其中,表觀滲透系數(shù)(Papp)計(jì)算公式如下[22]:

式中,dQ/dT:單位時(shí)間內(nèi)香豆素-6的透過量(μg/s);A:Transwell小室有效膜面積(cm2),本實(shí)驗(yàn)所用12孔Transwell小室有效膜面積為1.12 cm2;Co:初始加入微膠囊中香豆素-6濃度(μg/mL)。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取 為更直觀的展示兩種向微膠囊在Caco-2單層細(xì)胞中的吸收分布情況,利用香豆素-6的熒光特性,采用活細(xì)胞超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡，對1.2.7中轉(zhuǎn)運(yùn)180 min時(shí)的Caco-2單層細(xì)胞進(jìn)行觀察,具體步驟為:轉(zhuǎn)運(yùn)180 min后,棄去AP與BL兩側(cè)培養(yǎng)液,先用DPBS緩沖液多次沖洗兩側(cè),并小心將單層細(xì)胞連同Transwell聚碳酸酯膜一同剝離后,AP側(cè)朝上平鋪在載玻片上,采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,條件:激發(fā)波長488 nm、掃描方式xyz、掃描速度400 Hz、光譜分光速度100 nm·ms-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)及微膠囊表征

以PEG-PLGA為壁材,以納豆激酶微膠囊的包封率為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示。

表2 PEG-PLGA納豆激酶微膠囊制備的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiment for nattokinase loaded PEG-PLGA microcapsules preparation

表3 納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)吸收結(jié)果Table 3 Transportation and absorption of nattokinase loaded microcapsules in Caco-2 cell

由表2中極差值(R)可知,影響納豆激酶微膠囊包封率大小的四個(gè)因素順序?yàn)?壁材濃度>PVA濃度>二級均質(zhì)時(shí)間>二級均質(zhì)轉(zhuǎn)速;由四個(gè)因素不同水平所對應(yīng)的包封率大小可知,當(dāng)壁材濃度、PVA濃度、二級均質(zhì)轉(zhuǎn)速和二級均質(zhì)時(shí)間分別取5 mg/mL、1%、17500 r/min和7.5 min時(shí)可得到最大包封率。

采用上述制備條件制得PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊,表征結(jié)果如下:包封率分別為61.54%±2.36%和58.76%±2.54%,平均粒徑分別為(271.33±7.1) nm和(255.75±3.3) nm,PDI分別為(0.263±0.023)和(0.231±0.014),ζ電位分別為(-20.17±1.42)和(-24.73±2.36) mV。與采用傳統(tǒng)壁材阿拉伯膠和明膠[6]所制備納豆激酶微膠囊相比,本實(shí)驗(yàn)所制備的兩種納豆激酶微膠囊粒徑為納米級,這一性質(zhì)可能賦予微膠囊進(jìn)入血液循環(huán)的功能[23]。兩種微膠囊納豆激酶包封率較高,分散性良好,且采用優(yōu)化后參數(shù)制備所得兩種微膠囊各項(xiàng)表征參數(shù)無明顯差異。

2.2 微膠囊體外模擬緩釋

微膠囊體外模擬緩釋結(jié)果如圖1所示。2 h時(shí),PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA微膠囊兩種微膠囊的納豆激酶累積釋放率分別為36.2%±3.2%和39.3%±3.9%;在腸道環(huán)境中,兩種微膠囊的納豆激酶累積釋放率均增加緩慢,24 h時(shí),兩微膠囊的累積釋放率分別為71.7%±3.8%和78.6%±2.9%,兩者的緩釋率變化趨勢一致。Jain等[14]制備了PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種胰島素微膠囊,0～2 h(pH1.6),累積釋放率分別為37%±2.86%和40%±2.46%,24 h時(shí)累積釋放率分別為52%±3.51%和56%±3.17%,與之相比,本實(shí)驗(yàn)制備的微膠囊在胃環(huán)境中釋放率相差不大,但在腸道環(huán)境具有更高的釋放率,即有更好的腸溶效果。綜合分析,兩種微膠囊在胃環(huán)境中2 h納豆激酶的釋放率均小于40%,即納豆激酶仍有超60%被完整保留下來進(jìn)入腸道環(huán)境,且在腸道環(huán)境下表現(xiàn)出一定的緩釋效果,因而除葉酸靶向及納米促吸收外,還有望通過延長吸收時(shí)間而提高吸收量[24]。

圖1 兩種納豆激酶微膠囊在體外模擬胃腸環(huán)境中的釋放Fig.1 Gastrointestinal release curve in vitro of two kinds of nattokinase loaded microcapsules

2.3 MTT法評估納豆激酶微膠囊的細(xì)胞毒性

兩種微膠囊的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖2所示,由圖可知當(dāng)濃度小于500 μg/mL時(shí),Caco-2細(xì)胞存活率均高于98%,且各組間無顯著差異;當(dāng)濃度為750 μg/mL時(shí),PEG-PLGA納豆激酶微膠囊實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率顯著下降(p<0.05),說明此濃度下,PEG-PLGA納豆激酶微膠囊對Caco-2細(xì)胞有一定的細(xì)胞損傷;而使細(xì)胞存活率顯著(p<0.05)下降的FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊濃度為1000 μg/mL。所有實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率均大于85%,細(xì)胞毒性分級為0或1級,即兩種微膠囊無細(xì)胞毒性[26]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇不引起明顯細(xì)胞損傷的500 μg/mL為兩種微膠囊的最高添加量,并用于后續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)中。

圖2 兩種納豆激酶微膠囊對Caco-2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of two kinds of nattokinase loaded microcapsules on the survival rate of Caco-2 cell注:不同小寫字母表示差異性顯著(p<0.05)。

2.4 Caco-2單層細(xì)胞模型建立與評價(jià)

經(jīng)21 d培養(yǎng)后，分別對Caco-2單層細(xì)胞模型的TEER值、堿性磷酸酶活性、熒光素鈉透過率進(jìn)行測定。一般認(rèn)為，單層細(xì)胞TEER值在200～1000 Ω·cm2之間，即認(rèn)為所建立的細(xì)胞具有良好的完整性[26]。TEER值及極性分化測定結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)前期，TEER值無明顯變化，從第6 d至第11 d，TEER值迅速從83.6 Ω·cm2增大至約600 Ω·cm2，從第12 d開始，TEER值增速減緩并最終穩(wěn)定在750 Ω·cm2左右，說明Caco-2單層細(xì)胞完整性良好。此外，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，AP、BL兩側(cè)堿性磷酸酶活力比逐漸增大，21 d時(shí)達(dá)11.8，說明Caco-2單層細(xì)胞出現(xiàn)極性分化現(xiàn)象。

圖3 Caco-2單層細(xì)胞模型TEER值變化及AP、BL兩側(cè)堿性磷酸酶酶活比值變化Fig.3 Change of TEER and ratio of alkaline phosphatase enzyme activity(AP and BL)in Caco-2 monolayer cells

轉(zhuǎn)運(yùn)2.5 h后，若AP→BL和BL→AP兩個(gè)方向上熒光素鈉的累積透過率均不超過1%，即可認(rèn)為單層細(xì)胞的完整性和緊密性良好，所建單層細(xì)胞模型可用于轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)。熒光素鈉透過率測定結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AP→BL方向上，2.5 h熒光素的累積透過率不超過1%，BL→AP方向上，2.5 h的累積透過率不超過0.1%，說明單層細(xì)胞之間連接緊密。

圖4 熒光素鈉透過率Fig.4 Sodium fluorescein transmittance

綜合評價(jià),本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的Caco-2單層細(xì)胞之間連接緊密,具有良好的致密性和完整性,且已極性分化,可用于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)。

2.5 Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)

一般認(rèn)為,Papp>1.0×10-5cm/s表明物質(zhì)在人體中能夠被完全吸收,Papp在0.1×10-6～1.0×10-6cm/s之間,物質(zhì)的吸收率為1%～100%,當(dāng)Papp≤1.0×10-7cm/s時(shí),即可視為物質(zhì)不能被吸收[27];若兩個(gè)方向上Papp比值Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)在0.5～2.0之間,則表明物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制主要為被動轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。

PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知,在AP→BL方向上,兩種納豆激酶微膠囊的頂側(cè)表觀滲透系數(shù)Papp(AP→BL)均大于1.0×10-6cm/s,最高分別可達(dá)2.367×10-6和3.497×10-6cm/s,說明Caco-2單層細(xì)胞對兩種微膠囊均有很高的吸收率,可能是由于微膠囊為納米級,且良好的生物相容性,從而促進(jìn)了納豆激酶微膠囊在小腸細(xì)胞中吸收[29];相同的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間,FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的Papp(AP→BL)均顯著(p<0.05)高于PEG-PLGA微膠囊,說明前者在Caco-2單層細(xì)胞中具有更高的吸收率,推測可能是壁材FA-PEG-PLGA中的葉酸分子與Caco-2細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合而將微膠囊內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,從而促進(jìn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用[30]。隨著時(shí)間的延長,PEG-PLGA微膠囊Papp(AP→BL)未出現(xiàn)明顯的變化,且兩側(cè)Papp比值Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)穩(wěn)定在1.4～1.5之間,由此推測該種微膠囊的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收方式主要為被動轉(zhuǎn)運(yùn)。隨著時(shí)間的延長,FA-PEG-PLGA微膠囊的Papp(AP→BL)值逐漸降低,且兩個(gè)方向上的Papp比值從0.757減小至0.495,由此推測轉(zhuǎn)運(yùn)吸收過程除了被動轉(zhuǎn)運(yùn)之外,還可能存在P-糖蛋白等介導(dǎo)的外排機(jī)制[31],也可能是因?yàn)槿~酸受體與葉酸的結(jié)合作用趨于飽和,從而導(dǎo)致比值下降。

2.6 激光共聚焦觀察Caco-2細(xì)胞對微膠囊的攝取

采用激光共聚焦顯微鏡觀察Caco-2單層細(xì)胞吸收兩種納豆激酶微膠囊后示蹤劑香豆素-6的分布情況,結(jié)果如圖5和圖6所示。白光掃描結(jié)果顯示,細(xì)胞表面均完整且無明顯凸起或凹陷,說明細(xì)胞完整性良好;488 nm波長掃描結(jié)果顯示,熒光主要分布在細(xì)胞之間與細(xì)胞邊緣,且FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊在Caco-2細(xì)胞中熒光強(qiáng)度及分布范圍明顯大于PEG-PLGA納豆激酶微膠囊,這一結(jié)果與2.5中FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的Papp(AP→BL)顯著高于PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的結(jié)果一致。

圖5 香豆素-6示蹤PEG-PLGA納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細(xì)胞中吸收情況的激光共聚焦顯微鏡觀察圖Fig.5 LSCM observation of coumarin-6 traced PEG-PLGA nattokinase microcapsules absorbed in Caco-2 monolayer cells注:a:白光;b:488 nm。

圖6 香豆素-6示蹤FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細(xì)胞中吸收情況的激光共聚焦顯微鏡觀察圖Fig.6 LSCM observation of coumarin-6 traced FA-PEG-PLGA nattokinase microcapsules absorbed in Caco-2 monolayer cells注:a:白光;b:488 nm。

綜上,細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Caco-2單層細(xì)胞對兩種微膠囊均有很好的吸收,其中對PEG-PLGA微膠囊的吸收方式主要是被動擴(kuò)散,對于FA-PEG-PLGA微膠囊的吸收方式除被動擴(kuò)散之外還可能存在主動轉(zhuǎn)運(yùn)方式,因而表現(xiàn)出更高的吸收效果,但是否是由葉酸與Caco-2細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合而促進(jìn)吸收,以及是否存在P-糖蛋白等介導(dǎo)的外排作用均有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以PEG-PLGA為壁材,通過正交試驗(yàn)確定PEG-PLGA納豆激酶微膠囊雙重乳液蒸發(fā)法制備的最適條件為:壁材濃度5 mg/mL、PVA濃度1%、二級均質(zhì)轉(zhuǎn)速17500 r/min、二級均質(zhì)時(shí)間7.5 min;在此條件下制備的PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納米級納豆激酶微膠囊的平均粒徑分別為(271.33±7.1)和(255.75±3.3) nm,包封率分別為61.54%±2.36%和58.76%±2.54%,并以香豆素-6為熒光探針制備得PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種香豆素-6示蹤的納豆激酶微膠囊;兩膠囊的體外模擬釋放結(jié)果表明在胃環(huán)境中2 h,納豆激酶仍有超60%不被釋放,且在腸道環(huán)境下表現(xiàn)出一定的緩釋效果。兩種微膠囊對Caco-2細(xì)胞均無明顯細(xì)胞毒性;兩種微膠囊在Caco-2細(xì)胞中的Papp(AP→BL)均大于2.0×10-6cm/s,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果同樣顯示兩者吸收良好,且FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊具有更好的吸收,但FA-PEG-PLGA是否存在葉酸受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)尚有待進(jìn)一步研究。

綜上,PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA均可用于納米級納豆激酶微膠囊的制備,具有胃環(huán)境保護(hù)及腸道緩釋作用,無明顯細(xì)胞毒副作用,細(xì)胞吸收效果良好,本實(shí)驗(yàn)為通過葉酸靶向作用促進(jìn)納豆激酶的細(xì)胞吸收研究提供了依據(jù)。