山藥水溶性蛋白質(zhì)凝膠特性的研究

高 琦,于昊蕊,陳佳男,王曉文,張俊偉,薛友林,*

(1.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110036; 2.遼寧行政學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110161)

山藥是薯蕷科薯蕷屬(Dioscoreaspp,Dioscoreaceae)的一種常見(jiàn)的塊莖作物,具有藥食兼用的特點(diǎn),為一年或多年生蔓生草本植物[1]。我國(guó)擁有豐富的山藥資源,種植面積廣,具有較高的產(chǎn)量和悠久的藥用歷史,具有降血脂,降血糖,抗衰老,調(diào)理腸胃,增強(qiáng)免疫等功能[2]。通常山藥(干重)中淀粉含量為75%～84%,粗蛋白含量為6%～8%,粗纖維含量為1.2%～1.8%[3]。另外,山藥中含有多種生物活性物質(zhì),例如:酚類(lèi)化合物、糖蛋白、多糖、甾體皂甙等,其還含有豐富的人體需要的必需氨基酸等17種氨基酸,其中谷氨酸和精氨酸含量較高[4],故擁有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。山藥儲(chǔ)藏蛋白Dioscorin占山藥總可溶性蛋白(YSP)的80%,其分子量為31 kDa,且在體內(nèi)和體外都能表現(xiàn)出較好的生物活性,包括碳酸酐酶活性、胰蛋白酶抑制劑活性、抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗高血壓活性、凝集素活性、呼吸道上皮細(xì)胞保護(hù)活性等[5],因此有作為保健品或食品功能性添加成分的潛力,需要對(duì)其加工特性進(jìn)行深入研究[6]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,YSP具有較好的溶解性、持油力及乳化活性,這些能力對(duì)其應(yīng)用于食品體系來(lái)說(shuō)十分重要[7]。

蛋白的膠凝作用是指變性蛋白分子聚集并形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過(guò)程,是蛋白質(zhì)的一種重要的功能性質(zhì),同時(shí)其凝膠的流變學(xué)特性也可以作為調(diào)整食品物理性質(zhì)的重要依據(jù)[8]。此外,蛋白的凝膠行為及其流變學(xué)性質(zhì)與某些食品中獨(dú)特的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、感觀品質(zhì)、保水性和保留其他成分的能力有著密不可分的關(guān)系[9]。在食品中添加植物蛋白,例如大豆分離蛋白[10],可以增加其水分含量,由于其良好的凝膠組織性,使食品的質(zhì)構(gòu)和口感得到很好的改善,同時(shí)在一定程度上可以降低食品中脂肪含量,顯著提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值。

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)YSP的研究一般集中在蛋白質(zhì)的提取工藝的優(yōu)化,還有物理性質(zhì)和功能性質(zhì)的研究,例如:溶解度、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及穩(wěn)定性等[11],但是對(duì)山藥蛋白質(zhì)凝膠特性的詳細(xì)研究鮮有報(bào)道。有研究認(rèn)為,蛋白質(zhì)凝膠形成受加熱溫度、加熱時(shí)間、pH、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度等因素的影響[12]。因此,本文利用質(zhì)構(gòu)儀和流變儀對(duì)YSP的凝膠特性進(jìn)行研究,可以為綜合開(kāi)發(fā)山藥新產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白玉山藥 沈陽(yáng)十二線果品蔬菜批發(fā)市場(chǎng);氯化鈉、亞硫酸氫鈉 均為分析純;甲基硅油 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PHS-3CB型pH計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司;TG16G臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;FB124電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)博勒飛Brookfield;TH-400 BQ型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司;磁力攪拌器 上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;恒溫水浴鍋 上海啟前電子科技有限公司;漩渦振蕩器 廣東安勝儀器有限公司;TA-DHR2型流變儀 美國(guó)TA儀器;Microza MF/UF小型膜試驗(yàn)設(shè)備 日本Asahi Kasei公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 YSP的提取 首先將山藥洗凈、去皮、切塊,加入一定量的冰水抽提溶液進(jìn)行打漿(料液比為1∶2),并加入1%的亞硫酸氫鈉作為護(hù)色劑,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至9,在4 ℃時(shí)磁力攪拌20 min,5000 r/min離心30 min,雙層紗布過(guò)濾后取上清液,用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至3.5(根據(jù)初步研究確定山藥可溶性蛋白的等電點(diǎn)pI=3.5),4 ℃磁力攪拌1 h后,5000 r/min離心30 min,雙層紗布過(guò)濾,得到的沉淀加水回溶,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7,最后經(jīng)過(guò)超濾(截留物質(zhì)的分子量為10 kDa)、冷凍干燥獲得YSP[13]。

1.2.2 YSP最小凝膠濃度的測(cè)定 根據(jù)Aluko等的方法[14],測(cè)定YSP的最小凝膠濃度(LGC),將不同蛋白質(zhì)濃度(2%～14%,w/v)(2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%)的樣品懸浮在水中,95 ℃水浴1 h,在自來(lái)水中冷卻,然后放在冰箱(4 ℃)冷卻2 h。取出燒杯并倒置,其最低樣品濃度使凝膠不滑動(dòng)即為最小凝膠濃度。

1.2.3 YSP凝膠的制備

1.2.3.1 不同YSP濃度的凝膠的制備 分別取YSP 0.40、0.50、0.60、0.70 g于燒杯中,并加入蒸餾水,分別配制成質(zhì)量濃度為8%、10%、12%、14%的YSP溶液,調(diào)節(jié)pH=7,漩渦振蕩器攪拌10 min,95 ℃水浴1 h,然后4 ℃冷卻24 h,即得到不同蛋白質(zhì)濃度的凝膠。

1.2.3.2 不同pH的YSP凝膠的制備 固定YSP濃度為8%,分別調(diào)節(jié)pH為8、9、10、11,后續(xù)處理同1.2.3.1,即得到不同pH下的凝膠。

1.2.3.3 不同NaCl濃度的YSP凝膠的制備 固定YSP濃度為8%,體系的pH為7,將YSP分別溶于不同濃度的NaCl(0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L)溶液中,后續(xù)處理同1.2.3.1,即得到不同NaCl濃度的凝膠。

1.2.4 YSP凝膠流變性質(zhì)的測(cè)定 將制備好的凝膠置于流變儀平行板之間,間隙設(shè)為1 mm,抹去過(guò)多的樣品,并在樣品裸露的邊緣處涂上一層薄薄的甲基硅油,避免水分蒸發(fā)[15]。隨著時(shí)間的變化,測(cè)定不同溫度下G′(儲(chǔ)能模量,Storage modulus)、G″(損耗模量,Loss modulus)、剪切速率的變化。在振蕩(oscillation)和溫度梯度(temperature ramp)模式下設(shè)置升溫程序(起始溫度25 ℃,終止溫度95 ℃)和降溫程序(起始溫度95 ℃,終止溫度25 ℃),升溫和降溫速率均為5.0 ℃/min,角頻率(angular frequency)為1.0 rad/s[16]。最后在25 ℃下進(jìn)行頻率掃描(frequencysweep),頻率掃描范圍為0.1～10 Hz。

1.2.5 YSP凝膠持水性的測(cè)定 利用離心法測(cè)量凝膠持水性(water holding capacity,WHC),將濃度分別為8%、10%、12%、14%的YSP溶液1 mL放置在1.5 mL的離心管中,至于恒溫水浴鍋中,保持水浴溫度為95 ℃,在此條件下加熱1 h蛋白形成凝膠,燒杯從水浴中取出置于常溫流水中冷卻,冷卻至室溫,放于4 ℃冰箱冷卻24 h待測(cè)。將離心管從冰箱取出,放置在室溫下,當(dāng)溫度達(dá)到室溫時(shí),以6000 r/min的速度離心15 min,用濾紙條吸取離心出來(lái)的水,記錄離心管、離心前離心管與凝膠的重量和離心后離心管與凝膠的重量,凝膠持水性計(jì)算如下:

式中:WHC為凝膠持水性;W1為離心管重(g);W2為離心前離心管與凝膠的重量(g);W3為離心后離心管與凝膠的重量(g)[17]。

1.2.6 YSP凝膠質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 凝膠特性利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定,采用texture profile analysis(TPA)運(yùn)行模式。測(cè)試前速度為2.00 mm/s,測(cè)試速度為2.00 mm/s,測(cè)試后速度2.00 mm/s,穿刺距離為2.0 mm,間隔時(shí)間為5 s,數(shù)據(jù)頻率200 pps[18],探頭為T(mén)A11/1000圓柱型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用OriginPro8、IBM SPSS Statistics 19等軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 YSP的最小凝膠濃度

植物蛋白在加熱時(shí)形成凝膠的能力在食品加工和食品功能特性配方中有很大作用。蛋白質(zhì)凝膠形成能力和粘彈性與內(nèi)部結(jié)構(gòu)、共價(jià)鍵和氫鍵、靜電和疏水相互作用有密切關(guān)系。Sathe等研究發(fā)現(xiàn)蛋白的溶解性和非蛋白成分可以影響凝膠形成[19]。根據(jù)表1結(jié)果顯示,山藥蛋白的最小凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%,表明山藥水溶性蛋白質(zhì)具有較好的凝膠能力。

表1 YSP最小凝膠濃度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination result of the minimum gel concentration of YSP

2.2 YSP的凝膠特性

蛋白質(zhì)凝膠實(shí)際上是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶劑及相鄰肽鏈間吸引力、排斥力相互平衡的結(jié)果。形成蛋白質(zhì)凝膠的作用力與穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力大致相同。除在蛋白凝膠結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位的共價(jià)鍵外,一般認(rèn)為,一些物理作用力如疏水相互作用、靜電相互作用等也參與蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。其中一些觀點(diǎn)認(rèn)為,凝膠的流變特性與凝膠聚集的顆粒大小、顆粒的體積分?jǐn)?shù)以及凝膠的分形維數(shù)密切相關(guān)[20]。

2.2.1 YSP濃度對(duì)山藥蛋白質(zhì)凝膠特性的影響 儲(chǔ)能模量G′代表能量?jī)?chǔ)存后可恢復(fù)的彈性性質(zhì),損耗模量G″代表能量消散的粘性性質(zhì)[21]。根據(jù)圖1(a、b)的動(dòng)態(tài)流變結(jié)果和表2的質(zhì)構(gòu)結(jié)果顯示,所測(cè)樣品的G′均大于G″,隨著蛋白質(zhì)濃度增大,G′與G″均顯著增大(p<0.05),山藥蛋白質(zhì)凝膠的硬度也隨著YSP濃度的增大而增大。根據(jù)頻率掃描的測(cè)定顯示,由圖1c可知,損耗角正切值tanδ在測(cè)試的頻率范圍內(nèi),隨著蛋白質(zhì)濃度的升高而降低,表明在不同頻率下,蛋白質(zhì)濃度越小的凝膠,流動(dòng)性越好,tanδ為G″與G′比值,tanδ越大,表明體系的粘性比例越大,流動(dòng)性強(qiáng),反之則彈性比例較大[22]。相同蛋白質(zhì)濃度的G′曲線和G″曲線變化趨勢(shì)基本相同,且G′>G″,tanδ<1,說(shuō)明YSP凝膠以彈性為主體系,隨著蛋白質(zhì)濃度增大,彈性增強(qiáng),具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)性[23]。這表明增大蛋白質(zhì)濃度有助于凝膠具有更好的粘彈性和硬度。由于蛋白質(zhì)濃度增大,單位體積內(nèi)蛋白質(zhì)分子的碰撞與纏結(jié)幾率增大,氫鍵相互作用增強(qiáng)[24],同時(shí),蛋白質(zhì)分子間熱運(yùn)動(dòng)隨溫度升高而加劇,導(dǎo)致流動(dòng)阻力減小。

圖1 YSP濃度對(duì)山藥蛋白質(zhì)凝膠G′(a)、G″(b)、和tanδ(c)的影響Fig.1 Effects of YSP concentration on the G′(a),G″(b)and tanδ(c)of YSP gel

蛋白質(zhì)之間交聯(lián)聚集形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以鎖住并保持水分,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)鎖住水分能力的大小,是在食品應(yīng)用中衡量凝膠優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)[25]。如表2所示,山藥蛋白質(zhì)凝膠具有良好的持水性,這種良好的持水性和凝膠的蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān),也和其蛋白質(zhì)良好的溶解性有關(guān)[26]。凝膠的硬度的增大也有利于水的保持。所以隨著蛋白質(zhì)濃度的增加,凝膠的持水性也有所增大,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度大于12%時(shí),持水性達(dá)到70%以上。這種良好的持水性,可以使山藥蛋白凝膠廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中,如肉類(lèi)替代品,烘焙食品等?？梢愿鶕?jù)凝膠的持水性,在生產(chǎn)中調(diào)節(jié)水的用量來(lái)處理新產(chǎn)品的感官性狀。

蛋白質(zhì)濃度(w/v)硬度(N)彈性(mm)持水性(%)8%0.24±0.05b0.84±0.00b56.46±0.14c10%0.26±0.02b0.92±0.04ab56.97±0.06c12%0.28±0.00ab0.90±0.03ab73.38±0.03b14%0.34±0.04a0.96±0.04a76.68±0.35a

2.2.2 pH對(duì)YSP凝膠特性的影響 由圖2可以看出,在所測(cè)范圍內(nèi),pH=9時(shí),儲(chǔ)能模量G′、損耗模量G″和tanδ達(dá)到最大。在90 ℃左右時(shí),凝膠的粘彈性最好,隨著溫度的降低,G′也明顯下降。在堿性的條件下,由表3可以看出,隨著pH的增大,凝膠的硬度、彈性和持水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。蛋白質(zhì)分子中包含羧基與氨基,能夠呈現(xiàn)典型的兩性特征。pH對(duì)凝膠的粘彈性有較大的影響,山藥蛋白的等電點(diǎn)在3.5左右,當(dāng)pH>pI時(shí),凝膠中多數(shù)蛋白質(zhì)通過(guò)解離氫離子而帶負(fù)電荷,蛋白質(zhì)分子之間的相互排斥,蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用能有利于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[27]。隨著pH提高,凝膠中不溶物也有所減少,持水性較好[28]。pH>9時(shí),蛋白質(zhì)分子中的凈負(fù)電荷密度過(guò)大,分子間的靜電斥力就會(huì)大于分子間作用,使蛋白質(zhì)凝膠形成和維持的作用力減弱[29],分子鏈變得比較舒展[30],不利于蛋白質(zhì)分子的聚集,粘彈性減弱。

圖2 pH對(duì)山藥蛋白質(zhì)凝膠G′(a)、G″(b)、和tanδ(c)的影響Fig.2 Effects of pH on the G′(a), G″(b)and tanδ(c)of YSP gel

表3 pH對(duì)山藥蛋白凝膠硬度、彈性和持水性的影響Table 3 Effects of pH on gel hardness,resilience and water holding capacity of YSP

2.2.3 NaCl濃度對(duì)YSP凝膠特性的影響 由圖3可以看出,當(dāng)NaCl濃度為0.1 mol/L時(shí),山藥蛋白凝膠的G′和G″較大;同時(shí),由表4可以看出,當(dāng)NaCl濃度超過(guò)0.05 mol/L時(shí),將使凝膠的硬度降低,這與YSP凝膠形成時(shí)的動(dòng)態(tài)過(guò)程一致[31]。在不同頻率下,NaCl濃度對(duì)tanδ的影響較小。加入少量NaCl有助于凝膠持水性增強(qiáng)。蛋白質(zhì)凝膠形成首先經(jīng)歷變性展開(kāi),使疏水基團(tuán)暴露出來(lái),蛋白質(zhì)分子間作用使之發(fā)生交聯(lián)形成集聚體,繼而形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由于中性電解質(zhì)NaCl溶液影響電荷和極性基團(tuán)之間的靜電相互作用力,通過(guò)對(duì)水分子結(jié)構(gòu)的修飾而影響疏水相互作用,加熱蛋白質(zhì)溶液時(shí),包埋的非極性側(cè)鏈暴露出來(lái),從而增強(qiáng)了鄰近多肽間非極性片段的疏水相互作用。適量NaCl的添加能夠減弱分子間斥力作用,可以促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合[32],形成的凝膠隨機(jī)聚集較為粗糙[33]。而高濃度的NaCl會(huì)減小蛋白質(zhì)之間的靜電斥力,屏蔽電荷效應(yīng),增大分子間的吸引力,使蛋白質(zhì)的構(gòu)象趨于穩(wěn)定,凝膠的粘彈性硬度減弱[34]。另一方面,高濃度的NaCl還會(huì)破壞凝膠中的次級(jí)鍵,水合鍵和氫鍵,改變凝膠形成區(qū)域周?chē)男螒B(tài)從而破壞凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,使凝膠G′和G″降低。

圖3 NaCl濃度對(duì)山藥蛋白質(zhì)凝膠G′(a)、G″(b)、和tanδ(c)的影響Fig.3 Effects of NaCl concentrationon the G′(a),G″(b)and tanδ(c)of YSP gel

表4 NaCl濃度對(duì)山藥蛋白質(zhì) 凝膠硬度、彈性和持水性的影響Table 4 Effects of NaCl concentration on gel hardness and resilience and water holding capacity of YSP

3 結(jié)論

山藥水溶性蛋白質(zhì)凝膠的粘彈性隨著蛋白質(zhì)濃度的增大而增大,pH為9時(shí),儲(chǔ)能模量G′、損耗模量G″和tanδ達(dá)到最大,NaCl濃度超過(guò)0.05 mol/L時(shí),凝膠的硬度較低。在蛋白質(zhì)濃度為14%,pH為9,NaCl濃度為0.05 mol/L時(shí)具有最好的持水性。對(duì)其流變性和質(zhì)構(gòu)的研究,可以為山藥類(lèi)食品的創(chuàng)新提供依據(jù)。