梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德反應(yīng)工藝優(yōu)化及揮發(fā)性物質(zhì)分析

徐靜馨,陳 靜,2,*,唐 琪,鄧尚貴,2

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022; 2.浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316000)

美拉德反應(yīng)又稱為“非酶棕色化反應(yīng)”,是一種廣泛存在于食品工業(yè)的非酶褐變,是羰基化合物和氨基化合物間的反應(yīng),所以又稱羰氨反應(yīng)。美拉德反應(yīng)是食品加工過程中產(chǎn)生誘人色澤和各種芳香風(fēng)味的主要原因,也是目前各種香精制備的主要工藝。目前,國內(nèi)外有很多關(guān)于美拉德反應(yīng)的報(bào)道[1-2]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以改善反應(yīng)底物原有的生物活性,賦予其抗氧化、降血壓、抗菌活性、抗癌、抗誘變等多種生物活性[3-5]。

梅魚作為我國主要的海洋加工魚類,產(chǎn)量和需求量相當(dāng)大。在加工生產(chǎn)中,作為下腳料的魚頭、魚骨和內(nèi)臟往往被加工成魚粉或直接作為廢物被處理,造成大量的浪費(fèi),高值化利用程度較低。因此綜合利用梅魚下腳料,提高梅魚下腳料高值化利用具有重要意義。目前,將水產(chǎn)品下腳料酶解液與適當(dāng)?shù)倪€原糖通過美拉德反應(yīng)制備具有風(fēng)味獨(dú)特的調(diào)味品受到廣泛關(guān)注。如劉安軍等[6]以帶魚下腳料酶解液為原料,添加一定比例的還原糖和氨基酸,通過美拉德反應(yīng)制備香精;董志儉等[7]以魷魚內(nèi)臟酶解液為基料,利用美拉德反應(yīng)制備魷魚味香精;從艷君等[8]將草魚內(nèi)臟蛋白酶解液與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后制備出了風(fēng)味良好的調(diào)味基料。目前,利用梅魚內(nèi)臟酶解液為基料,與還原糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備風(fēng)味物鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅魚內(nèi)臟 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司,冰藏條件下當(dāng)日運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn);木瓜蛋白酶(酶活力1000 U/mg) 上海金穗生物科技有限公司;其它試劑 均為市售分析純;實(shí)驗(yàn)用水 為蒸餾水。

HWS-12電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;CR21G型冷凍離心機(jī) 日本日立公司;DZF-6021型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司;S-3C型pH計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司;高速低溫離心機(jī)A1301019 上海艾測電子科技公司;TM-767型攪拌機(jī) 中山市海盤電器有限公司;AR124CN 電子天平 奧豪斯儀器有限公司;UV1100紫外分光光度計(jì) 上海美普達(dá)公司;75 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭 美國SUPELCO公司;HP-INNOWAXS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司SHIMADZU;Agilent 7890A/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 梅魚內(nèi)臟的酶解 參考劉建偉等[28]的方法,改進(jìn)后稱取50 g梅魚內(nèi)臟放入燒杯中,按料液比1∶10 (m/v)加入蒸餾水,經(jīng)高速勻漿后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5,加入1 g木瓜蛋白酶后攪拌均勻,在55 ℃條件下恒溫酶解5 h,酶解結(jié)束后,將酶解液在沸水浴中滅酶20 min,8000 r/min離心20 min,除去懸浮物,過濾,所得濾液即為梅魚內(nèi)臟酶解液。

1.2.2 梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 糖種類和比例對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,將酶解液用氫氧化鈉溶液pH調(diào)至7,分別添加0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g的葡萄糖或木糖,或加入總量1 g的不同比例(葡萄糖和木糖的配比為4∶1、3∶2、1∶1、2∶3和1∶4)的混合糖,封口置于真空干燥箱中,在100 ℃下反應(yīng)100 min,冷卻后,用紫外分光光度計(jì)在420 nm[9]處測量吸光度,用以表示美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度,并進(jìn)行感官評分。

1.2.2.2 pH對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,加入5%葡萄糖攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH分別至5、6、7、8、9和10,封口置于真空干燥箱中,將酶解液在100 ℃下反應(yīng)100 min,冷卻后,用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測量吸光度,用以表示美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度,并進(jìn)行感官評分。

1.2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,將酶解液pH調(diào)至7,加入5%葡萄糖攪拌均勻,封口置于真空干燥箱中,在100 ℃下分別反應(yīng)20、40、60、80、100和120 min,冷卻后,用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測量吸光度,用以表示美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度,并進(jìn)行感官評分。

1.2.2.4 溫度對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 量取20 mL的上述酶解液于燒杯中,將酶解液pH調(diào)至7,加入5%葡萄糖攪拌均勻,封口置于真空干燥箱中,分別在70、80、90、100、100和120 ℃下反應(yīng)60 min,冷卻后,用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測量吸光度,用以表示美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度,并進(jìn)行感官評分。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以感官評分作為考察指標(biāo),對pH、溫度、時(shí)間和糖混合比例采用四因素三水平正交表對反應(yīng)條件進(jìn)一步優(yōu)化,其因素水平表如表1。

表1 正交因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評定 感官評定采用評分檢驗(yàn)法[10]。挑選食品專業(yè)的10名感官評定人員,評價(jià)指標(biāo)用魚腥味、香味、刺激氣味等來表示(表2),對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的樣品逐個(gè)進(jìn)行評分,最終得出感官綜合評分。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The standard of sensory evaluation

1.2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性物質(zhì)測定

1.2.5.1 頂空固相微萃取法(HS-SPME)提取揮發(fā)性成分 稱取5 g最優(yōu)條件下制得的樣品置于20 mL頂空瓶中,密封,于50 ℃磁力攪拌器中加熱平衡20 min,用活化后的75 μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭頂空吸附30 min后,將萃取頭插入GC進(jìn)樣口解析,進(jìn)入GC-MS 進(jìn)行分離與分析[11]。

1.2.5.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)條件 色譜條件:色譜柱:HP-INNOWAXS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純He;載氣流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;分流比5∶1進(jìn)樣;升溫程序:起始溫度為40 ℃,保持5 min,以8 ℃/min升至250 ℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:電離方式EI;電子能量70 eV;電壓1800 V;連接口溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z;質(zhì)量掃描速率10000 amu/s。

1.2.6 梅魚內(nèi)臟酶解液及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的測定

1.2.6.1 羥自由基(·OH)清除率的測定 取一支10 mL試管,分別加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL磷酸緩沖液(pH7.4)和1 mL去離子水,混勻之后,再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,加入1 mL雙氧水(0.12%,新鮮配制),混勻,在37 ℃水浴鍋中60 min,用去離子水調(diào)零,在536 nm處測定吸光度值,記作Ap;將1 mL雙氧水換做1 mL去離子水,記作Ab;將1 mL去離子水換做1 mL酶解液,記作As[12]。

式中:Ao為空白的吸光度;Ai為樣液的吸光度;Aj為酶解液的吸光度。

1.2.6.3 DPPH自由基(DPPH·)清除率的測定 1 mL DPPH無水乙醇溶液(10 mmol/L)+1 mL樣液作為實(shí)驗(yàn)組;1 mL DPPH無水乙醇溶液+1 mL去離子水作為對照組;1 mL無水乙醇+1 mL樣液作為空白組,混勻,30 ℃避光靜置30 min,在535 nm處測定吸光度[14]。

式中:A1為樣液的吸光度;A2為空白的吸光度;A3為DPPH溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,采用Origin 8.5軟件作圖。采用SPSS V17.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析,p<0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 葡萄糖、木糖添加量和葡萄糖與木糖配比對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 糖種類及配比對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1中a、b可知,420 nm處的吸光度不斷增加,說明兩種還原糖參與了美拉德反應(yīng),并且隨著還原糖含量的添加,美拉德反應(yīng)逐漸進(jìn)行,褐變程度隨之逐漸加深。然而當(dāng)葡萄糖、木糖添加量達(dá)到1.2 g時(shí),感官評分達(dá)到最大,分別為7.4、8.4,超過1.2 g時(shí),感官評分開始下降。與葡萄糖參與的反應(yīng)相比,木糖添加量在0.6～1.6 g時(shí),木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分要高于葡萄糖,說明木糖參與美拉德反應(yīng)的效果略優(yōu)于葡萄糖,相較于六碳糖葡萄糖,作為五碳糖的木糖,對美拉德反應(yīng)的進(jìn)行更有利。如圖1中c可知,隨著葡萄糖/木糖的比例逐漸減小，木糖占總糖比例的增加,美拉德反應(yīng)不斷進(jìn)行,褐變程度不斷加深。當(dāng)葡萄糖與木糖比例為1∶1時(shí),感官評分達(dá)到最大8.8,之后隨著葡萄糖/木糖比例減小，褐變程度的不斷加深,感官評分急劇下降,可能是因?yàn)殡S著木糖含量的添加,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會散發(fā)出不協(xié)調(diào)的酸味,干擾感官評分。

圖1 還原糖及其配比對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.1 Effects of reducing sugars and their proportions on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum visceral enzyme solution Maillard products

隨著葡萄糖/木糖比例的減小，褐變程度加深,具有香味的小分子物質(zhì)不斷產(chǎn)生,而小分子物質(zhì)又隨著反應(yīng)的不斷深化,聚合成大分子物質(zhì),香味動態(tài)平衡的狀態(tài)被減弱甚至打破,這也可能是由于在反應(yīng)過程中產(chǎn)生了刺激性氣味的物質(zhì)或者焦苦味,掩蓋了原有的香味,降低了感官效果,且基于成本考慮,葡萄糖低于木糖。最終確定以葡萄糖∶木糖為1∶1為混合糖。

2.1.2 pH對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 pH對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,當(dāng)pH為5時(shí),吸光值較小,說明美拉德反應(yīng)的程度較低,之后隨著pH的增加,美拉德反應(yīng)程度也隨之增加,在pH為9時(shí),酶解液美拉德反應(yīng)的程度最強(qiáng),之后隨著pH的增加,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度開始減輕。且在pH為9時(shí),感官效果最佳(評分為6.8分)。一般來說,美拉德反應(yīng)隨pH的升高而加劇,pH越大,反應(yīng)越強(qiáng),速度越快。在酸性條件下,美拉德反應(yīng)主要產(chǎn)生糠醛(戊糖)或者羥甲基糠醛(HMF)(己糖),美拉德反應(yīng)受到抑制,堿性條件下,葡糖氨重排產(chǎn)生還原酮,如丙酮醇、丙酮醛等物質(zhì)會進(jìn)一步參與美拉德反應(yīng)[15]。因此選定反應(yīng)體系的pH為9。

圖2 pH對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.2 Effects of pH on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum fish visceral enzyme solution Maillard products

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 美拉德反應(yīng)過程中,氨基酸和還原糖逐漸反應(yīng),形成大量褐色含氮色素,即類黑精色素,環(huán)化產(chǎn)生一系列吡啶、吡咯、吡嗪等含氮雜環(huán)化合物[16]。反應(yīng)時(shí)間對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響結(jié)果如圖3所示。如圖3所示,在20～120 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi),美拉德反應(yīng)隨著時(shí)間的延長而加深,感官效果也隨之增強(qiáng),然而其反應(yīng)速率不斷減小,有可能是因?yàn)槠咸烟请S著反應(yīng)進(jìn)行而不斷消耗。美拉德反應(yīng)越徹底,褐變程度隨之加深,感官評分也越高。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到100 min時(shí),感官評分達(dá)到最高為7.6分,120 min時(shí)，感官評分略有下降。因此最終確定反應(yīng)時(shí)間為100 min。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.3 Effects of reaction time on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum fish visceral enzyme solution Maillard products

2.1.4 溫度對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響 溫度對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物的影響如圖4所示。圖4顯示,當(dāng)溫度70 ℃時(shí),美拉德反應(yīng)程度較低,之后隨著反應(yīng)溫度的上升,吸光度增大,美拉德反應(yīng)程度也隨之上升,在100 ℃后,溫度變化對吸光值和感官評分影響較小,當(dāng)溫度達(dá)到120 ℃時(shí),美拉德反應(yīng)的程度最強(qiáng)，感官評分也隨著溫度的上升而不斷增加,在120 ℃達(dá)到最佳感官評分。溫度是影響美拉德反應(yīng)程度的關(guān)鍵因素之一,升高溫度將增加糖和氨基酸的相互作用,從而增加反應(yīng)速率,同時(shí),溫度較高時(shí)會形成大量的揮發(fā)性物質(zhì)。一般情況下,反應(yīng)模式的溫度不能超過180 ℃,溫度過高,會產(chǎn)生較強(qiáng)烈的氣味。綜上,最終選取100、110、120 ℃作為正交水平。

圖4 反應(yīng)溫度對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德產(chǎn)物吸光值(420 nm)及感官評分的影響Fig.4 Effects of reaction temperatures on the absorption value(420 nm)and sensory score of plum fish visceral enzyme solution Maillard products

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 美拉德反應(yīng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)對美拉德反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果及分析見表3。表3所示,影響美拉德反應(yīng)程度因素的主次順序依次是C>A>B>D,即溫度>pH>時(shí)間>葡萄糖/木糖。美拉德反應(yīng)最佳條件為A2B2C3D1,恰好是正交試驗(yàn)中的一組,即當(dāng)溫度為120 ℃、pH為9、反應(yīng)時(shí)間為100 min、葡萄糖/木糖為1∶1時(shí),感官評分最佳結(jié)果為7.48分。

表3 四因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment of four factors and three levels

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按上述最佳工藝條件,即反應(yīng)溫度120 ℃、反應(yīng)時(shí)間100 min、pH9.0、葡萄糖與木糖之比1∶1時(shí)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分的平均分為7.51±0.13。3次實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性較好、誤差較小,說明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確可行。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析

從表4～表5可知,從梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中總共檢測出89種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,其中醛類16種、含量46.79%;烴類12種、含量1.89%;酸類5種、含量2.11%;醇類8種、含量7.26%;呋喃類5種、含量3.04%;噻唑類5種、含量1.62%;吡嗪類4 種、含量1.31%;酯類11 種、含量24.84%;酮類9種、含量5.93%;其他化合物14種、含量5.21%。

表4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Volatile flavor compounds of Maillard reaction products

續(xù)表

表5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量Table 5 Types and contents of volatile flavor substances in Maillard reaction products

占較高含量(46.79%)的醛類物質(zhì)包含糠醛、3-糠醛、壬醛等,具有產(chǎn)生清香、果香和堅(jiān)果香的特質(zhì)[18],其中壬醛具有脂香味;糠醛具有獨(dú)特的烤肉香味[19];3-甲硫基丙醛對海鮮味[20]和肉香味[21]具有貢獻(xiàn)作用;己醛具有青草味[22]。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中檢測出醇類、酯類、酮類和酸類等,這些物質(zhì)本身都帶有獨(dú)特的香味,具有去腥增香的作用,對梅魚內(nèi)臟酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味形成具有重要的貢獻(xiàn)。含量為24.84%的酯類包含1,2-苯酸二乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯等,具有顯著香味特征對肉香味增加有貢獻(xiàn)。酮類物質(zhì)(含量5.93%)包含2-丙酮、β-紫羅蘭酮等,對魚肉氣味的貢獻(xiàn)相對較小,對腥味物質(zhì)起增強(qiáng)作用[29]。呋喃類化合物及其衍生物會產(chǎn)生魚香味、煮魚香味等獨(dú)特的芳香[23]。噻唑類對肉的總體風(fēng)味具有最基本的貢獻(xiàn),它是美拉德反應(yīng)的前期階段生成的,高溫是形成噻吩類物質(zhì)的先決條件[24]。

噻唑類一般氣味強(qiáng)烈,對肉香味以及海鮮味具有重要貢獻(xiàn)意義[20]。吡嗪類化合物主要提供堅(jiān)果味、燒烤味和甜味的產(chǎn)品[25],是風(fēng)味化合物中重要的組成部分,也是美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一[26]。

2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性

圖5 梅魚內(nèi)臟酶解液及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of enzymatic hydrolysis solution of fish offal and its Maillard reaction product注:圖中小寫字母不同,表示顯著差異(p<0.05)。

3 結(jié)論