不同劑量多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用

張慧敏 朱文烽 龐曉平 周鵬 陳方亮

阿爾茨海默?。ˋD）是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，是造成老年人癡呆最主要的原因[1]。根據(jù)2014年的報道，全球大約有4千多萬AD患者，預(yù)計到2050年，患者將增加至3倍[2]。AD的發(fā)生為患者及其家庭造成沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)，因此AD的預(yù)防和治療成為當(dāng)下急需解決的醫(yī)療和社會問題。各國癡呆診療指南均推薦膽堿酯酶抑制劑作為一線治療藥物，而膽堿酯酶抑制劑也在臨床中使用最為廣泛，代表性藥物為多奈哌齊[3-4]。APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠是目前最常用來評價AD治療藥物藥效以及考察藥物作用機制的動物模型。因此本研究選用APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠，評價不同劑量多奈哌齊對該模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，為進一步研發(fā)新藥提供參考。

1 對象和方法

1.1 實驗動物 雄性9月齡APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠80只、同齡野生型小鼠20只均購自南京大學(xué)模式動物研究所（合格證號：0022834，201400204），并于 SPF 級動物房飼養(yǎng)，光照時間為 8:00～20:00，室溫 20～26℃，濕度40%～70%。飼養(yǎng)期間小鼠自由進食和飲水，手術(shù)前后單獨飼養(yǎng)。飼料購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2002-001]。

1.2 儀器及試劑 Morris水迷宮（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；跳臺（BW-YLS-3TB，上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；水浴鍋（HH.S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；培養(yǎng)箱（XT5107，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司）；光度計（Ultrospec 6300pro，通用電氣醫(yī)療集團生命科學(xué)部）；顯微鏡（NIB900-FL，Nexcope）；多奈哌齊（日本衛(wèi)才制藥公司，規(guī)格：5mg/片，批號：140355A），其溶液以蒸餾水為溶媒，現(xiàn)用現(xiàn)配，配制終濃度分別為0.1、0.3、0.6mg/ml，按小鼠每 10g體重 0.1ml劑量給藥。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和給藥 小鼠進入實驗房適應(yīng)1周后，將APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為轉(zhuǎn)基因小鼠對照組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊1mg/kg組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊3mg/kg組和轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊6mg/kg組，每組20只，并以20只野生型基因小鼠作為野生型對照組。各組小鼠灌胃給藥1次/d（野生型小鼠對照組、轉(zhuǎn)基因小鼠對照組予等量蒸餾水），每周連續(xù)給藥5d，12周后進行Morris水迷宮和跳臺實驗。在水迷宮和跳臺實驗前1h繼續(xù)給予實驗藥物，直至實驗結(jié)束。實驗期間每天觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)和飲食情況，實驗開始前以及實驗開始后每隔2周稱體重并記錄。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮由一金屬圓柱形水池和自動顯示、記錄裝置，以及安全島（平臺）組成。水池分為4個象限（東、南、西、北），平臺放置于第二象限的中心。水溫保持在（24±2）℃，水中加入牛奶，使水不透明，平臺位于水面以下1.0cm。每只小鼠每天接受2次訓(xùn)練，每次分別從兩個不同的入水點開始，2次訓(xùn)練間隔4h，記錄潛伏期（找到平臺的時間）。如果小鼠在60s內(nèi)未找到平臺，則潛伏期以60s計算。無論在60s內(nèi)找到平臺與否，均讓小鼠在平臺上停留30s。連續(xù)訓(xùn)練6d，最后1d訓(xùn)練24h后進行探索實驗，移去平臺，小鼠自由游泳60s尋找平臺，記錄小鼠第一次穿過平臺所在位置的時間和穿越平臺的次數(shù)。

1.3.3 跳臺實驗 小鼠跳臺裝置為1個長方形反射箱，大小為10cm×10cm×30cm，用黑色塑料板分隔成為5間。底面為不銹鋼網(wǎng)柵，網(wǎng)柵間距為0.5cm。每間左后角放置一高3.2cm、直徑4.5cm的橡膠站臺。小鼠位于站臺上可免受電擊，當(dāng)小鼠跳下站臺時，則遭受到36伏電擊懲罰。本實驗連續(xù)進行3d，第1天為適應(yīng)階段，將小鼠面向墻角輕輕放置于站臺上，首先讓動物適應(yīng)環(huán)境5min，網(wǎng)柵不通電。第2天為學(xué)習(xí)階段，將小鼠面向墻角輕輕放置于站臺上，然后通以36伏交流電，持續(xù)3min。若動物跳下站臺則受電擊，其正常反應(yīng)應(yīng)該是跳回站臺以躲避傷害性刺激，多數(shù)動物可能會再次或多次跳至網(wǎng)柵上，受到電擊后又迅速跳回站臺。記錄每只小鼠受到電擊的次數(shù)（即錯誤次數(shù)）。第3天為實驗階段，即記憶保持實驗。將小鼠放置于站臺上，通電觀察，并記錄第一次跳下站臺的潛伏期和3min內(nèi)的錯誤次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠一般狀態(tài)的影響 給藥前后APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠活動良好，飲食正常。體重保持均勻，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表 1。

2.2 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

2.2.1 Morris水迷宮實驗 結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練時間延長，各組小鼠尋找到隱蔽平臺的潛伏期均逐漸縮短，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠與野生型小鼠比較，尋找到隱蔽平臺的潛伏期顯著延長（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)基因小鼠有明顯的學(xué)習(xí)記憶功能缺失。而多奈哌齊不同劑量給藥組的潛伏期均逐漸縮短，但與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比無統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。

訓(xùn)練階段結(jié)束后，進行平臺探索實驗。轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠第一次穿越原平臺所在位置的時間較野生型小鼠明顯延長（P＜0.05），而穿越平臺次數(shù)比野生型小鼠

表1 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠體重的影響（g）

表2 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能（潛伏期）影響（s）

明顯減少（P＜0.01），提示APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)空間記憶功能的明顯損害。與轉(zhuǎn)基因小鼠對照組比較，無論是在穿越平臺時間還是在穿越次數(shù)上，多奈哌齊不同劑量給藥組均無明顯改善，見表3。

表3 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能（穿越平臺）影響

2.2.2 跳臺實驗 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型對照組與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠的潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異。多奈哌齊不同劑量給藥組的潛伏期與野生型對照組與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比較均無明顯改變（見表4）。野生型對照組的錯誤次數(shù)僅為0.6±0.2，而轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠的錯誤次數(shù)為2.6±1.6，與野生型小鼠對照組相比具有增加的趨勢，但未達到統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），提示轉(zhuǎn)基因小鼠有一定程度的記憶缺失。給予多奈哌齊后，小鼠的錯誤次數(shù)均有減低，但個體差異較大，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能（跳臺實驗）影響

3 討論

AD是老年人中最常見的認知功能進行性下降的疾病，是發(fā)生在中樞神經(jīng)的一種病因復(fù)雜的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病[5]。由于AD的發(fā)病是多因素交叉引起，病理及生化的改變是多方面的，眾多的學(xué)者在研究過程中，形成了各自不同的假說，其中Aβ淀粉樣肽學(xué)說是目前大家對AD比較公認的發(fā)病機制[6]。而APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型是經(jīng)典的AD轉(zhuǎn)基因動物模型之一，此模型可穩(wěn)定表達人類突變基因APP和PS1，引起細胞外淀粉樣蛋白的沉積[7]，其優(yōu)勢是將兩個易感基因結(jié)合在一起，從而縮短病理變化時間，并使病理特征多樣化，能夠較好的模擬AD患者早期病理和行為特征[8]以及AD患者膽堿能系統(tǒng)的改變。多奈哌齊是目前臨床使用較廣泛的抗AD藥物之一[9]，本研究考查多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶改善作用。

在經(jīng)典的學(xué)習(xí)記憶實驗-水迷宮實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的學(xué)習(xí)記憶缺失，但多奈哌齊對APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能缺失無明顯改善作用，提示在此動物模型中多奈哌齊治療AD的作用沒有達到預(yù)期效果。

跳臺實驗是一種抑制性被動回避實驗，在記憶研究中，動物模型最重要的特點是抑制模仿活動或?qū)W習(xí)習(xí)慣。被動回避實驗通過動物學(xué)會去掉某種特定的行為而逃避某種厭惡的事情。跳臺實驗中，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠第一次穿越原平臺的時間較野生型小鼠明顯延長（P＜0.05），而穿越平臺次數(shù)比野生型小鼠明顯減少（P＜0.01），長期給予多奈哌齊不同劑量給藥組均不能縮短轉(zhuǎn)基因小鼠第一次穿越平臺的時間；多奈哌齊不同劑量給藥組的跳臺潛伏期與兩對照組相比較均無明顯改變，但跳臺錯誤次數(shù)均有減低，且個體差異較大，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，經(jīng)典行為學(xué)實驗表明，多奈哌齊并不能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。多奈哌齊主要通過增加AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平而發(fā)揮學(xué)習(xí)記憶改善作用，在東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠癡呆模型中，多奈哌齊顯示了良好的學(xué)習(xí)記憶改善作用[10]。但APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶缺失主要是由于APP和PS1基因突變引起的細胞外淀粉樣蛋白沉積引起，多奈哌齊可能并不能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ淀粉樣斑塊沉積而發(fā)揮抗AD作用。但在跳臺實驗中，多奈哌齊不同劑量給藥組的跳臺潛伏期與兩對照組相比較雖沒有明顯改變，但跳臺錯誤次數(shù)均有減低，提示APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠可能也伴有膽堿能系統(tǒng)功能的紊亂，但并不是引起APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠AD的主要原因。

總之，本實驗結(jié)果提示多奈哌齊不能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能缺失。同時，本研究也提示了AD的發(fā)病是機制的復(fù)雜，至今并沒有哪一種假說能夠完全地解釋AD的發(fā)生、發(fā)展。