基于取代苯甲酰肼縮丙酮酸配體的二芐基錫配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及生物活性

羅 波 余浩田 劉夢琴 張復(fù)興 鄺代治 譚宇星 蔣伍玖

(衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，功能金屬有機(jī)材料湖南省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，功能金屬有機(jī)化合物湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽421008)

0 引 言

癌癥的死亡率僅次于心腦血管疾病，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。目前，外科手術(shù)、放射性療法和化學(xué)療法是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中用來治療癌癥的3種主要手段，前兩者主要用于治療良性非轉(zhuǎn)移的腫瘤，后者主要針對晚期惡性、頑固性的腫瘤。因此，新型抗腫瘤藥物的研發(fā)對癌癥的治療具有重大意義。20世紀(jì)60年代末，順鉑（Ⅱ）抗癌作用的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用，開辟了金屬配合物抗癌藥物研究的新領(lǐng)域[1]。隨著人們對金屬配合物藥理作用認(rèn)識的進(jìn)一步深入，許多新型的具有抗癌活性的金屬配合物不斷被合成出來[2-4]。自1980年Crowe[5]首次報道二烴基錫化合物具有抑制癌細(xì)胞增殖作用以來，二烴基錫化合物在抗癌藥物領(lǐng)域受到了人們的廣泛關(guān)注。與其它結(jié)構(gòu)類型的有機(jī)錫化合物相比，二烴基錫化合物通常具有更好的抗癌活性[6-8]；但是常規(guī)二烴基錫化合物的生物兼容性差，脂水分配系數(shù)大，嚴(yán)重制約了其藥物應(yīng)用。因此，利用具有良好生物兼容性的配體同二烴基錫反應(yīng)制備新型有機(jī)錫配合物并研究其抗癌活性，這一工作就顯得更加重要。酰腙類化合物由于其良好的生物兼容性及復(fù)雜多變的配位模式，近年來得到了廣泛關(guān)注[9-12]。結(jié)合前期研究，本文擬考察不同電子類型取代基調(diào)控對芐基錫抗腫瘤活性的影響。我們選取苯環(huán)對位具有不同電子類型取代基的酰肼與丙酮酸縮合產(chǎn)物作為配體，合成了2個二芐基錫配合物，初步研究了配合物對癌細(xì)胞的體外抑制活性，并通過熒光光譜及凝膠電泳法研究了配合物與DNA的作用情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

IR用日本島津Prestige-21紅外光譜儀(4 000～400 cm-1，KBr壓片) 測定；1H、13C 和119Sn NMR 用Bruker AVANCE-500核磁共振儀測定；元素分析用PE-2400（Ⅱ）元素分析儀測定；晶體結(jié)構(gòu)用Bruker SMART APEXⅡCCD單晶衍射儀測定；HRMS用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL(ESI源)測定；熒光光譜用日本日立F-7000熒光光譜儀測定；凝膠電泳用北京六一儀器廠DYY-6C型電泳儀測定；熱重用德國NETZSCH TG 209 F3熱重分析儀；熔點(diǎn)用北京泰克X-4雙目體視顯微熔點(diǎn)測定儀測定 (溫度計未經(jīng)校正)。取代苯甲酰肼縮丙酮酸配體和二芐基二氯化錫參考文獻(xiàn)[13-14]方法合成。溴化乙錠(EB)、小牛胸腺DNA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，質(zhì)粒pBR322 DNA定制于上海生工生物工程公司。其它試劑均為分析純，溶劑參考文獻(xiàn)[15]方法純化，水為超純水。Tris-HCl(0.01 mol·L-1)緩沖溶液通過稱取一定量Tris用0.1 mol·L-1的鹽酸溶液調(diào)至pH值為7.40，使用前配制。小牛胸腺DNA的純度通過比較260和280 nm處的吸光度來確定(A260/A280=1.8～1.9)，用所需pH值條件下緩沖溶液配制，濃度通過測定260 nm處的吸光度計算而得(ε260=6 600 L·mol-1·cm-1)，其儲備液置于4℃保存；溴化乙錠溶液通過稱取適量溴化乙錠固體，用pH=7.40的Tris-HCl(0.01 mol·L-1)緩沖溶液配制。

1.2 配合物的合成

于50 mL圓底燒瓶中，加入1 mmol對甲氧基苯甲酰肼縮丙酮酸或?qū)ο趸郊柞ｋ驴s丙酮酸，1 mmol二芐基二氯化錫，25 mL甲醇，攪拌回流6 h。冷卻，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，用甲醇重結(jié)晶，得淡黃色晶體C1或C2。

配合物C1：產(chǎn)率78.3%。m.p.189～191℃。元素分析(C26H28N2O5Sn)實(shí)測值(括號內(nèi)為計算值，%)：C，55.11(55.05)；H，4.93(4.98)；N，4.92(4.94)。 IR(KBr，cm-1)：3 419，3 078，3 020，2 935，2 835，1 633，1 602，1 581，1 490，1 390，1 334，1 251，1 172，1 211，1 082，1 029，921，842，758，696，638，624，590，551，514，459。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ7.98(d，J=9.0 Hz，2H)，6.893～7.01(m，12H)，3.90(s，3H)，3.25(s，4H)，2.04(s，3H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ174.49，168.33，162.89，151.13，136.41，130.73，128.31，128.24，125.40，125.34，113.50，55.43，50.85，34.30，12.77。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ-606.55。 HRMS(ESI)m/z按 C25H25N2O4Sn+[M-CH3OH+H]+計算值:537.083 08，實(shí)測值:537.082 46。

配合物 C2：產(chǎn)率 74.6%。 m.p.118～120℃(dec)。元素分析 (C25H25N3O6Sn)：實(shí)測值 (括號內(nèi)為計算值，%)：C，51.59(51.58)； H，4.37(4.33)；N，7.21(7.22)。IR(KBr，cm-1)：3 404，3 080，3 057，3 024，2 937，1 678，1 620，1 598，1 529，1 492，1 452，1 384，1 338，1 292，1 205，1 157，1 105，1 068，1 014，921，858，759，719，696，592，553，536，459。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ8.29(d，J=8.4 Hz，2H)，8.21(s，1H)，8.13(d，J=8.8 Hz，2H)，6.94～6.99(m，9H)，3.33(s，4H)，2.07(s，3H)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)：δ172.58，162.19，149.90，138.66，129.59，128.98，128.61，128.39，128.16，125.70，123.36，50.90，40.84，13.05。119Sn NMR(Me4Sn，187 MHz，CDCl3)：δ-634.61。 HRMS(ESI)m/z按 C24H22N3O5Sn+[M-CH3OH+H]+計算值：552.057 59，實(shí)測值：552.057 50。

圖1 配合物的合成線路圖Fig.1 Synthetic routes of the complexes

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測定

選取尺寸為 0.26 mm×0.24 mm×0.23 mm(C1)和0.22 mm×0.20 mm×0.18 mm(C2)的配合物晶體，在Bruker SMART APEXⅡCCD單晶衍射儀上，采用經(jīng)石墨單色化的 Mo Kα 射線(λ=0.071 073 nm)，以φ～ω掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp因子和多重掃描吸收校正。晶體結(jié)構(gòu)由直接法解出，部分非氫原子坐標(biāo)在隨后的差值Fourier合成中陸續(xù)確定，理論加氫法給出氫原子在晶胞中的位置坐標(biāo)。對非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)和氫原子坐標(biāo)及其各向同性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正至收斂，全部結(jié)構(gòu)分析計算工作采用SHELX-97程序系統(tǒng)完成[16]。

CCDC：1895352，C1；1895353，C2。

表1 配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of the complexes

續(xù)表1

1.4 體外抗癌活性測定

將待測藥物溶于少量DMSO，用水稀釋至所需濃度，保持最終DMSO濃度小于0.1%。MCF7、HepG2、H460細(xì)胞株取自美國組織培養(yǎng)庫(ATCC)，MCF7、HepG2、H460細(xì)胞株用含 10%胎牛血清的RPMI 1640(GIBICO公司)培養(yǎng)基，在5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)。體外抗癌藥敏試驗(yàn)是通過MTT法測定。數(shù)據(jù)處理使用Graph Pad Prism version 7.0程序，化合物IC50通過程序中具有S形劑量響應(yīng)的非線性回歸模型進(jìn)行擬合得到。

1.5 配合物與DNA-EB作用的熒光光譜法研究

在5 mL容量瓶中分別加入小牛胸腺DNA、EB及不同濃度的配合物溶液，混勻，25℃下放置3.5 h，分別掃描熒光光譜，激發(fā)波長為258 nm，發(fā)射波長見圖譜，激發(fā)和發(fā)射光譜掃描狹縫寬度均為5.0 nm。

1.6 配合物與質(zhì)粒p BR322 DNA作用的凝膠電泳法研究

在凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，使用TAE(pH=8.0)緩沖液和1%瓊脂糖制備凝膠，用Goldview染色。將不同濃度配合物溶液與質(zhì)粒pBR322 DNA(0.5μg·μL-1)混合均勻，并在25℃孵育1 h，然后將其加入凝膠中，在150 V的電泳槽中電泳45 min，電泳結(jié)束后在UV光下進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 譜學(xué)研究

在配合物C1和C2的紅外譜圖中，C1和C2配位鍵的特征峰 ν(Sn-O)、ν(Sn-O-Sn)、ν(Sn-N)和 ν(Sn-C) 分別位于 590、551、514、459 cm-1和 592、553、536、459 cm-1處，與文獻(xiàn)[17-20]報道的類似化合物的出峰位置一致，由此表明有機(jī)錫配合物的形成。

在1H NMR譜中，其各組峰的積分面積之比與預(yù)期結(jié)構(gòu)的各組質(zhì)子數(shù)相對吻合[21]；從譜圖中可以看到，配合物C1和C2中芳環(huán)上氫質(zhì)子的出峰位置分別在7.01～7.98和6.99～8.29；芐基上亞甲基氫質(zhì)子分別在3.25和3.33出峰，N-(2-丙酸)-芳甲酰腙配體上甲基氫質(zhì)子分別出峰在2.04和2.07，2個配合物的氫質(zhì)子出峰基本保持一致，說明2個配合物具有相似的不對稱結(jié)構(gòu)單元。在13C NMR譜中，其各組峰與理論推測結(jié)構(gòu)碳原子數(shù)相吻合[21]，與X射線單晶衍射結(jié)果一致。在119Sn NMR譜中，C1和C2分別在-606.55和-634.61處呈現(xiàn)一個單峰，表明2個配合物中均僅存在一種單一的有機(jī)錫化合物。

2.2 晶體結(jié)構(gòu)

配合物C1、C2的主要鍵長和鍵角數(shù)據(jù)列于表2，分子結(jié)構(gòu)見圖2、3。在配合物C1中，配合物C1的不對稱結(jié)構(gòu)單元通過Sn-Oi鍵作用構(gòu)成一維螺旋鏈狀結(jié)構(gòu)，如圖4所示，其Sn-Oi鍵鍵長為0.261 58(18)nm，雖大于Sn-Oi共價鍵長，但是小于錫原子與氧原子范氏半徑之和，且比文獻(xiàn)報道[22-23]相似配合物的Sn-Oi略短，說明配合物C1的一維螺旋鏈狀結(jié)構(gòu)是由較強(qiáng)的Sn-Oi鍵作用構(gòu)成。鏈中的每1個螺旋由 2個[p-MeO-C6H3(O)C=N-N=C(Me)COO](CH3OH)(C6H5CH2)2Sn單元組成，其長度為0.928 38(27)nm，并且相鄰的錫原子之間的距離為0.606 06(4)nm，夾角為 99.997(4)°。

配合物C1的中心錫原子Sn1與來自配體中的2個氧原子O1和O2，1個亞氨基氮原子N2，1個配位甲醇氧原子O5，來自2個對甲基芐基中的亞甲基碳原子C12和C19以及來自另1個配體分子中的O3i等配位，形成七配位五角雙錐構(gòu)型。 O1、O2、O5、N2、O3i占據(jù)了赤道平面的5個位置，2個亞甲基碳原子C12和C19則占據(jù)了該平面兩側(cè)的軸向位置，軸向 C12-Sn1-C19 鍵角為 158.85(10)°，與 180°偏離了21.15°，且赤道平面的5個原子與中心錫原子的鍵長不等(dSn1-O1=0.218 20(16)nm；dSn1-O2=0.226 86(17)nm；dSn1-O5=0.252 5(2)nm；dSn1-N2=0.224 65(19)nm；dSn1-O3i=0.261 58(18)nm)，其差值為 0.002 21～0.043 38 nm，且鍵角也不相等(∠O1-Sn1-O5 74.24(7)°；∠O1-Sn1-N2 70.03(7)°；∠N2-Sn1-O2 69.95(6)°；∠O2-Sn1-O3i70.486(56)°；∠O5-Sn1-O3i75.413(64)°)，因此，該配合物中心錫原子為七配位畸變五角雙錐構(gòu)型。

表2 配合物的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of the complexes

圖2 配合物C1的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Molecular structure of complex C1

圖3 配合物C2的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Molecular structure of complex C2

圖4 配合物C1一維螺旋鏈狀結(jié)構(gòu)Fig.4 One dimensional infinite helical chain structure of C1

配合物C2為雙錫核分子，分子中心存在1個Sn2O2平面中心四元環(huán)，環(huán)的中心就是分子的對稱中心，四元環(huán)由羧基氧原子以μ3-橋聯(lián)配位Sn原子，且與2個錫原子的鍵長不等，其中dSn1-O2=0.231 14(16)nm，屬于正常Sn-O共價鍵長；而dSn1-O2i=0.276 50(15)nm，雖小于錫原子與氧原子范氏半徑之和，但是大于配合物C1中的Sn-Oi鍵鍵長，說明該Sn-Oi鍵的作用比配合物C1中的弱。與配合物C1相似，配合物C2的中心錫原子Sn1也是形成七配位五角雙錐構(gòu)型。軸向 C11-Sn1-C18鍵角為 165.49(11)°，與 180°偏離了14.51°，比配合物C1的偏離程度小，在配合物C2中，赤道平面的5個原子與中心錫原子的鍵長也均不相等，因此，配合物C2中心錫原子也為七配位畸變五角雙錐構(gòu)型。

2.3 熱穩(wěn)定性研究

為了研究配合物的熱穩(wěn)定性，采用NETZSCH TG 209 F3熱重分析儀，在空氣氛下，加熱速度為20℃·min-1，氣體流速為 20 mL·min-1，在 40～800 ℃范圍內(nèi)對配合物進(jìn)行熱重測試。如圖5、6所示，隨溫度的升高，配合物發(fā)生相似的失重過程。在初始階段40～180 ℃，配合物 C1 失重為 5.54%(理論值:5.64%)，C2為5.22%(理論值：5.50%)，分別對應(yīng)配合物失去配位的甲醇分子；配合物C1、C2的中間失重階段均相對模糊，在170～800℃范圍內(nèi)失重，對應(yīng)配合物分子失去取代苯甲酰肼縮丙酮酸配體及芐基，最終穩(wěn)定在約26.43%(C1)和26.58%(C2)，殘余物與SnO2的計算含量26.57%(C1)及25.89%(C2)吻合；上述熱分析結(jié)果表明配合物C1、C2分別在90、118℃之前可穩(wěn)定存在。

圖5 配合物C1的熱重分析Fig.5 Thermogravimetric analysis curve of complex C1

圖6 配合物C2的熱重分析Fig.6 Thermogravimetric analysis curve of complex C2

2.4 體外抗癌活性研究

表3列出了配合物C1、C2和卡鉑對體外培養(yǎng)癌細(xì)胞NCI-H460(人肺癌細(xì)胞)、HepG2(人肝癌細(xì)胞)、MCF7(人乳腺癌細(xì)胞)的抑制活性。從表中數(shù)據(jù)可知，配合物C1、C2對3種癌細(xì)胞都有一定的抑制作用，配合物C1對NCI-H460最為敏感，其IC50=(4.66±0.27)μmol·L-1。 在 HepG2 和 MCF7 兩種癌細(xì)胞中，C1、C2的抑制活性相當(dāng)；在NCI-H460癌細(xì)胞中，C1的體外抑制活性優(yōu)于卡鉑，C2略低于卡鉑。結(jié)合配合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)效分析可以發(fā)現(xiàn)：配合物C1、C2晶體結(jié)構(gòu)類型雖然不同，但其在溶液中的存在結(jié)構(gòu)相似(高分辨質(zhì)譜及核磁共振結(jié)果表明其在溶液中均可以單分子形式存在)，說明配體酰肼苯環(huán)對位不同電子類型的取代基對配合物的抗癌活性影響較小。由此推測，配體酰肼苯環(huán)對位取代基可能不是有效藥效基團(tuán)；另一方面，二芐基錫配合物具一定的抗癌活性，這可能和配體與有機(jī)錫的協(xié)同作用有關(guān)[24-25]。

2.5 配合物與DNA-EB作用的熒光光譜研究

圖7為不同濃度的配合物C1對EB-DNA復(fù)合體系的熒光淬滅曲線。加入配合物C1，DNA-EB體系的熒光明顯降低，說明配合物C1的存在使DNAEB體系的熒光產(chǎn)生了猝滅[26]。為了較為定量地研究配合物與DNA的結(jié)合能力，根據(jù)經(jīng)典Stern-Volmer方程[27-28]：I0/I=1+KSVccomplex，由曲線擬合推斷其作用屬于靜態(tài)猝滅，計算出配合物C1與DNA作用的猝滅常數(shù) KSV為 7.0×104L·mol-1，比文獻(xiàn)[29-30]報道的結(jié)合常數(shù)大，其大小定量地反映出配合物與DNA插入作用的能力，通過比較結(jié)合常數(shù)可以看出配合物C1與DNA存在較強(qiáng)的插入作用，推測可能是配合物的中心錫原子與DNA分子中的堿基基團(tuán)配位結(jié)合，配合物中的端基配體芳環(huán)插入到DNA的堿基對中，競爭了EB與DNA的結(jié)合，把EB從DNA分子的堿基對中擠出。

圖7 配合物C1與EB-DNA體系相互作用的熒光光譜圖Fig.7 Effect of complex C1 on the fluorescent spectra of EB-DNA system

表3 配合物對癌細(xì)胞的體外抑制活性Table 3 Inhibition action of the complexes to cancer cell in Vitro

2.6 配合物與質(zhì)粒p BR322 DNA作用的凝膠電泳法研究

通過凝膠電泳法研究了不同濃度的配合物C1切割超螺旋pBR322 DNA的能力，結(jié)果如圖8所示。從圖8可以看出，配合物C1可以有效地切割雙鏈DNA，并且其切割活性與配合物濃度有關(guān)。當(dāng)配合物濃度逐漸增加時，可觀察到FormⅠ逐漸減少，而FormⅡ逐漸增加。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)慢慢解體為缺刻開環(huán)型[31-32]，并且隨著配合物濃度的增加，切割效果更加明顯。但是，當(dāng)濃度達(dá)到120μmol·L-1時，仍然沒有出現(xiàn)線性(FormⅢ)。因此，配合物C1對DNA的切割活性結(jié)果表明，配合物C1能有效地將超螺旋DNA切割成缺刻型DNA。

圖8 配合物C1切割質(zhì)粒DNA pBR322的凝膠電泳圖Fig.8 Agarose gel electrophoresis of pBR322 treated with different concentrations of C1

3 結(jié) 論

二芐基二氯化錫分別與對甲氧基苯甲酰肼縮丙酮酸及對硝基苯甲酰肼縮丙酮酸反應(yīng)，合成了2個芐基錫配合物(C1、C2)。結(jié)構(gòu)分析表明，C1通過Sn-O鍵構(gòu)成一維無限螺旋鏈狀結(jié)構(gòu)，C2為雙錫核分子，以Sn2O2四元環(huán)為中心對稱，2個配合物的中心錫原子與配位原子均形成七配位畸變五角雙錐構(gòu)型。熱分析結(jié)果表明，在空氣氛下，配合物C1在90℃、C2在118℃以下可穩(wěn)定存在?？拱┗钚越Y(jié)果表明C1、C2對HepG2和MCF7兩種癌細(xì)胞的抑制作用無明顯區(qū)別，僅對于NCI-H460癌細(xì)胞，配合物C1優(yōu)于配合物C2。在Tris-HCl緩沖溶液中，以EB作為熒光探針，用熒光光譜法初步研究了配合物C1與小牛胸腺DNA的相互作用，配合物C1與小牛胸腺DNA作用是插入結(jié)合作用所致；并且用凝膠電泳法研究了配合物C1切割質(zhì)粒DNA pBR322的能力，結(jié)果表明配合物C1能有效地將超螺旋DNA pBR322切割成缺刻型DNA。

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